大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin C結(jié)構(gòu)域與抑制活性的關(guān)系.pdf

1、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是我國重要的海水經(jīng)濟養(yǎng)殖魚種。隨著大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，海水養(yǎng)殖過程中由細菌、病毒和寄生蟲所引起的病害問題日益嚴重，導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 半胱氨酸蛋白酶(cysteineproteases)存在于所有生物中，在各種生理和病理過程中發(fā)揮著非常重要的作用。研究表明，半胱氨酸組織蛋白酶抑制劑（cystatin）對半胱氨酸蛋白酶活性的調(diào)節(jié)對生物體正常生理功能的發(fā)揮是非常重要的。

2、cystatin是一類天然的、能與組織蛋白酶緊密結(jié)合的可逆抑制劑，廣泛分布于動物組織和體液中。cystatin包含3個保守的結(jié)構(gòu)域，即N-末端的Gly、第一個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Gln-X-Val-X-Gly和第二個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Pro-Trp，它們對cystatin的抑制活性至關(guān)重要。在前期研究中通過對大黃魚脾臟轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了一條編碼哺乳類cystatinC同源物的表達序列標簽（expressedsequencetag，EST），命名為大

3、黃魚cystatinC(lyccystatinC)。本文進一步對lyccystatinC進行了序列分析，發(fā)現(xiàn)lyccystatinC的第一個和第二個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的cystatin家族成員不同，分別為Gln79-Val-Thr-Asn-Val83和Pro125-Arg126。Blastp分析發(fā)現(xiàn)，在魚類中存在一類與lyccystatinC的第一個和第二個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)類似的cystatin。進化分析表明，這類cystatin家族成員形

4、成一個獨立的一簇，提示可能是一類具有新結(jié)構(gòu)域的cystatin。
　　 本文系統(tǒng)地研究了lyccystatinC3個保守區(qū)域中的各保守氨基酸在cystatin抑制活性中的作用。通過定點突變和刪除突變的方法分別構(gòu)建了20個lyccystatinC突變體重組表達質(zhì)粒，并在畢赤酵母中進行了重組表達，得到了純化的重組蛋白，測定了它們對papain、cathepsinL和S（組織蛋白酶L和S）的抑制常數(shù)。實驗結(jié)果顯示:(1)將lyccys

5、tatinC成熟肽N-末端Gly35（包括Gly35）前面的17個氨基酸刪除后，其對papain抑制常數(shù)增加177倍，對大黃魚cathepsinL和S則完全沒有抑制活性。分別將Leu33殘基和Gly35殘基分別突變?yōu)锳rg，實驗結(jié)果表明Leu33突變?yōu)锳rg之后，突變體蛋白rlyccystatinCL33R（表示將lyccystatinC第33位氨基酸由Leu突變?yōu)锳rg，rlyccystatinC為重組表達lyccystatinC，下

6、同）對papain和cathepsinS的抑制活性沒有顯著性影響，但對cathepsinL的抑制活性降低了約9倍;將Gly35突變?yōu)锳rg之后，突變體蛋白rlyccystatinCG35R對三種組織蛋白酶均沒有抑制活性。(2)通過刪除整個Gln79-Val-Thr-Asn-Val83區(qū)域后，發(fā)現(xiàn)刪除Gln79-Val-Thr-Asn-Val83后的突變體蛋白rlyccystatinCdel-QVTNV（del-QVTNV表示將QVTNV

7、刪除，下同）完全失去抑制活性，不能抑制任何一種組織蛋白酶的活性;突變體rlyccystatinCQ79I對papain的抑制常數(shù)增加207倍，但對cathepsinL和S的抑制常數(shù)只增加了14倍和3倍;突變體rlyccystatinCQ79P對papain、cathepsinL和S都失去抑制活性;突變體rlyccystatinCV80G對papain的抑制常數(shù)增加654倍，而對cathepsinL和S的抑制常數(shù)只增加了15.8倍和36倍

8、，突變體rlyccystatinCV80E對papain的抑制常數(shù)增加202倍，而對cathepsinL和S的抑制常數(shù)只增加了3.8倍和3.4倍，突變體rlyccystatinCV80K對papain的抑制常數(shù)增加582倍，而對cathepsinL和S的抑制常數(shù)只增加了4.57倍和3.56倍;將Thr81突變?yōu)閂al后對其活性沒有顯著性改變，但若將Thr81突變?yōu)镚lu后其對papain的抑制常數(shù)增加191倍，而對cathepsinL和

9、S的抑制常數(shù)只增加了13.66倍和38.71倍;將Asn82突變?yōu)門yr，Val83突變?yōu)镚ly和Phe后對其活性沒有顯著性改變;而刪除Gln79、Thr81和Val83后其對papain、大黃魚cathepsinL和S完全沒有抑制活性。(3)將第三個保守區(qū)域的Arg126替換為Trp的突變體蛋白rlyccystatinCR126W對papain、cathepsinL和S的抑制活性與野生的lyccystatinC相當，而替換為Gly的突

10、變體蛋白rlyccystatinCR126G對papain的抑制活性與野生的rlyccystatinC相當，但對cathepsinL和S的抑制常數(shù)都提高10倍左右。這些結(jié)果表明lyccystatinC的N-末端及該末端的Gly35、第一個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)Gln79-Val-Thr-Asn-Val83是lyccystatinC抑制活性必不可少的;第一個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，Gln79、Val80和Thr81側(cè)鏈基團性質(zhì)的改變會顯著性影響lyccys

11、tatinC抑制活性，而其他兩個氨基酸的改變不會顯著性影響lyccystatinC的抑制活性，與其他cystatin不同，Val83突變?yōu)镚ly和Phe未對lyccystatinC抑制活性造成大的影響，說明Val83的側(cè)鏈基團并不會影響第一個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)和第二個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的相互作用;第三個保守區(qū)域Arg126突變?yōu)镚ly不會對lyccystatinC對papain的抑制活性造成大的影響，但對cathepsinL和S的影響較大，Arg1

12、26突變?yōu)門rp對其活性沒有顯著性影響說明lyccystatinC的第二個β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)與cystatin家族其他成員不同并不顯著影響其活性。上述結(jié)果表明本lyccystatinC與papain家族半胱氨酸組織蛋白酶的相互作用與其他cystatin存在不同。本文研究結(jié)果有利于進一步了解cystatin抑制papain家族半胱氨酸組織蛋白酶活性的分子機制。
　　 為了研究大黃魚cystatinC在抗原提呈中的作用，本文克隆表達了大黃