家蠶桿狀病毒表達(dá)的hGM-CSF的純化及糖基化分析.pdf

1、hGM-CSF是一種重要的造血調(diào)控因子，能誘導(dǎo)粒細(xì)胞前體和巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞呈集落性生長(zhǎng)，在促進(jìn)粒細(xì)胞恢復(fù)方面療效顯著，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。由于糖基化程度和派生細(xì)胞類型的不同，重組細(xì)胞能產(chǎn)生多種形式、大小不同的hGM-CSF，其分子量變化從16-50 kDa。糖基化可影響hGM-CSF的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，抗原性和毒性，對(duì)于延長(zhǎng)血清半衰期有很重要的作用，糖基化程度高的動(dòng)物細(xì)胞源的rhGM-CSF在體內(nèi)穩(wěn)定性方面優(yōu)于酵母和大腸桿菌源的，因此

2、純化家蠶桿狀病毒表達(dá)的hGM-CSF以及分析其糖基化有一定的研究意義。
　　 本研究首先對(duì)接種hGM-CSF的蠶蛹粉進(jìn)行了Western blot鑒定，在PVDF膜上能雜交到特異性條帶，通過夾心法ELISA檢測(cè)到蠶蛹粉中hGM-CSF蛋白的含量為2‰左右。而后開展了小規(guī)模純化預(yù)實(shí)驗(yàn)，蠶蛹粉中含有大量的雜質(zhì)及油脂，因此采用高速離心、硫酸銨分級(jí)沉淀和超濾對(duì)蠶蛹粉進(jìn)行粗純化，通過Resource Q陰離子交換色譜能使目的蛋白得到富集，

3、進(jìn)行免疫共沉淀進(jìn)一步純化目的蛋白，得到了微量較純的hGM-CSF。家蠶桿狀病毒表達(dá)的hGM-CSF不帶His、GST等標(biāo)簽，只能采用離子交換色譜、親和層析、分子排阻色譜等方法來達(dá)到純化的目的，而采用親和層析方法進(jìn)行大規(guī)模純化需要大量的抗體，因此在進(jìn)行小規(guī)模純化實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，免疫新西蘭雄兔制備了hGM-CSF多克隆抗體，獲得了大量多克隆抗血清，并將抗體用親和層析柱純化，為接下來的大規(guī)模純化實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。大規(guī)模實(shí)驗(yàn)通過高速離心、硫酸銨分級(jí)沉

4、淀和超濾對(duì)蠶蛹粉進(jìn)行粗純化，采用DEAE陰離子交換色譜和抗體親和層析柱進(jìn)一步純化，獲得了一定量(2 mg)較純的hGM-CSF，而通過這些方法的純化，hGM-CSF的含量也由最初的2.30‰上升到了204.50‰。利用N型糖苷酶PNGase F和Endo H對(duì)較純的hGM-CSF進(jìn)行了酶切去糖基化分析，去糖基化后的hGM-CSF在SDS-PAGE和Western blot上顯示比去糖基化前小1-2 kDa，說明hGM-CSF蛋白有N型糖