編碼hGM-CSF基因慢病毒載體的構(gòu)建及其介導的腫瘤疫苗抗腫瘤活性的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建編碼人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(human Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor,hGM-CSF)的慢病毒載體，研究編碼hGM-CSF的慢病毒載體對樹突狀細胞(dendritic cell，DC)疫苗抗腫瘤活性的增強作用。 方法：1、以質(zhì)粒pORFhGM-CSF為模板，采用PCR方法擴增出hGM-CSF基因片段；通過BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點

2、，將hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒連接載體L166中構(gòu)建重組載體L166-hGM-CSF；2、大量提取重組質(zhì)粒L166-hGM-CSF和包裝載體L205、包膜蛋白L311，采用CaCl<,2>法將這3個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染慢病毒包裝細胞293T，72h后收集病毒上清，0.45μm負壓過濾得到hGM-CSF基因修飾的慢病毒顆粒Lenti-hGM-CSF;同樣方法獲得編碼GFP的慢病毒顆粒Lenti-GFP；3、將收獲的慢病毒顆粒Lenti-G

3、FP以不同濃度感染Hela細胞，熒光顯微鏡下計數(shù)綠色熒光的量，由此得到該病毒的滴度；4、采用EIJSA方法測定編碼hGM-CSF基因的慢病毒Lenti-hGM-CSF感染Hela細胞后hGM-CSF的分泌量；5、從臍血中分離出單核細胞，rhGM-CSF、rhIL-4和α-TNF誘導獲得DC，通過相差顯微鏡和流式細胞儀鑒定，MTT方法檢測DC刺激同種T淋巴細胞增殖能力；6、應(yīng)用反復凍融法制備可溶性腫瘤抗原，分別將負載腫瘤抗原的DC疫苗和慢

4、病毒Lenti-hGM-CSF感染的負載腫瘤抗原的DC疫苗與T淋巴細胞共同培養(yǎng)，MTT方法檢測并比較兩者所誘導的CTL對靶細胞的體外殺傷活性。 結(jié)果：1、通過酶切電泳和測序證實hGM-CSF基因已克隆到慢病毒連接載體L166中；2、收集的慢病毒顆粒感染Hela細胞，病毒滴度達3.2×10<'6>IU/ml；3、ELISA法檢測慢病毒感染的Hela細胞上清液中hGM-CSF的表達明顯高于未感染者，且表達持續(xù)時間超過2個月；4、由臍

5、血獲得的單核細胞，培養(yǎng)3～5天后有大量細胞懸浮生長，形態(tài)不規(guī)則，相差顯微鏡下可見細胞有伸展的大量毛刺，為典型的DC形態(tài)。流式細胞(Flow Cytometry,FCM)結(jié)果顯示高表達CD80(87.2﹪)和CD86(92.8﹪)，而CD14的表達率較低(3.56﹪)；5、經(jīng)慢病毒感染后負載腫瘤抗原的DC疫苗刺激同種T淋巴細胞增殖的能力和抗腫瘤活性較未轉(zhuǎn)染者明顯增強(p<0.01)。 結(jié)論：1、成功制備了hGM-CSF基因修飾的慢