BmAGO3的表達(dá)研究及新型家蠶桿狀病毒的構(gòu)建.pdf

1、從家蠶cDNA文庫中篩選出一條序列(GenBank登錄號:NM-001104597.2)，其開放閱讀框大小為2781bp，編碼由926個氨基酸殘基組成的蛋白。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，編碼的蛋白預(yù)測分子量大小為104.5kDa，等電點(diǎn)為9.0，與其它物種中argonaute3(AG03)蛋白同源性很高，故將該基因命名為BmAG03(BombyxmoriAG03)?？乖砦环治霁@得BmAG03蛋白的表面抗原區(qū)Kago-3，表達(dá)其表面抗原區(qū)K

2、ago-3，用于抗體制備。Kago-3片段ORF框為702bp，編碼234個氨基酸殘基，預(yù)測分子量27.34kDa，等電點(diǎn)8.88。
　　 首先PCR擴(kuò)增Kago-3片段并成功構(gòu)建pET-28a(+)-(Kago-3)重組載體，轉(zhuǎn)化EcoliBL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)WesternBlotting分析，在30kDa左右的位置出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期值30.9kDa(融合His標(biāo)簽為3.56kDa，kago-3為27.34

3、kDa)相符。用Nj2+柱親和層析法純化得到的Kago-3融合蛋白，對新西蘭雄兔進(jìn)行免疫獲得多克隆抗體，抗血清效價的ELISA檢測結(jié)果達(dá)到1∶51200。分別提取家蠶不同發(fā)育時期及五齡期不同組織總蛋白，WestemBlotting檢測BmAG03基因在家蠶各發(fā)育時期和五齡期各組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明，BmAGO3在家蠶卵、蛹、蛾與五齡幼蟲期均有表達(dá)，但表達(dá)水平有差異，從高到低依次是:蛾、五齡蠶、蛹和卵。BmAGO3的表達(dá)差異性在五齡幼蟲

4、各組織中也很明顯，在蠶血、頭和皮中表達(dá)量較高，在脂肪體和氣管中表達(dá)較少，在其它組織中沒有檢測到明顯表達(dá)。由于AGO蛋白是miRNA功能途徑的關(guān)鍵蛋白，因此，表達(dá)譜分析結(jié)果表明五齡幼蟲蠶血、頭和皮組織以及蛾期均有可能存在比較活躍的miRNA調(diào)控。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，BmAGO3蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步RNA干擾下調(diào)BmAGO3在BmN細(xì)胞中的表達(dá)水平，MTT法檢測RNA干擾前后細(xì)胞活力，分析表明，RNA干擾后，細(xì)胞活力上升。

5、r>　　 另外，為了研究家蠶桿狀病毒侵染細(xì)胞的機(jī)制，本研究還構(gòu)建了一個新型重組家蠶桿狀病毒。運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)將EGFP和RFP基因分別與桿狀病毒囊膜糖蛋白GP64基因和衣殼主要蛋白VP39基因串聯(lián)起來，構(gòu)建了一個能同時在桿狀病毒囊膜展示綠色熒光蛋白，在核衣殼展示紅色熒光蛋白的新型重組桿狀病毒，為研究家蠶桿狀病毒侵染機(jī)制和觀察侵染路徑提供了一個有力工具。同時該重組桿狀病毒能同時在囊膜和衣殼表面展示兩個蛋白，可以用于兩個抗原蛋白的同