農(nóng)桿菌介導(dǎo)木薯“新選048”遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立.pdf

1、木薯是重要的旱地經(jīng)濟(jì)作物及能源植物,廣西是我國木薯的主產(chǎn)區(qū),木薯“新選048”品種是廣西主栽品種之一,具有抗旱、高產(chǎn)的特點(diǎn),具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo),在優(yōu)良木薯品種中轉(zhuǎn)入抗逆性基因,獲得既高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)又具抗性的木薯新品種,是木薯育種的有效途徑。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo),在木薯“新選048”中轉(zhuǎn)入抗逆性基因,獲得如下研究結(jié)果:
　　1.以腋芽為外植體的再生體系建立
　　滅菌:春秋季節(jié)取外植體,以0.1％HgCl2處理12mi

2、n滅菌效果最好,污染率控制在30%以內(nèi),而成活率達(dá)到56.7%。
　　初代誘導(dǎo)培養(yǎng):添加KT的培養(yǎng)基外植體萌芽率比添加6-BA和TDZ的要高,最適培養(yǎng)基為MS+KT0.5mg/L,外植體腋芽萌發(fā)率可達(dá)85.0%,
　　增殖培養(yǎng):細(xì)胞分裂素與NAA配比的效果比單使用細(xì)胞分裂素或者與赤霉素配比的都好,以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基為最佳的增殖培養(yǎng)基,增殖率高,平均芽高度最高,可達(dá)5cm。
　　生

3、根培養(yǎng):在合適的濃度下,單獨(dú)添加NAA、IBA、IAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的生根率都可達(dá)到100%,平均根數(shù)以MS+NAA0.6mg/L培養(yǎng)基的最多,達(dá)6.9條。
　　移栽:控制空氣濕度尤為重要,相對濕度太大,則容易引起組培苗植株莖段發(fā)霉腐爛,影響成活率。試驗(yàn)中,移栽18d后存活率不足10%,因此移栽技術(shù)還需進(jìn)一步的研究。
　　2、無菌葉片再生體系的建立
　　選擇無菌葉片誘導(dǎo)愈傷組織,最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2,4-D5.0mg

4、/L,誘導(dǎo)率可達(dá)90%以上,愈傷組織淡黃色透明松軟,在進(jìn)一步培養(yǎng)中容易轉(zhuǎn)化為胚性愈傷組織。
　　愈傷組織的增殖培養(yǎng)基則以MS+2,4-D3.0mg/L為適宜,增殖率為90%。愈傷組織分化采用6-BA和NAA配合以及硫酸銅兩種處理來誘導(dǎo)不定芽,結(jié)果6-BA和NAA配合處理并沒有無菌芽的分化,而MS+CuSO4200mg/L處理有不定芽分化,但分化率不高。
　　3、遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立
　　以無菌葉片和愈傷組織作為材料進(jìn)

5、行抗生素選擇壓的試驗(yàn),以確定培養(yǎng)材料細(xì)胞全部死亡的最低抗生素濃度。試驗(yàn)結(jié)果為葉片抗生素選擇壓的培養(yǎng)基為MS+3.0mg/L2,4-D+2.3g/LKm,而愈傷組織抗生素選擇壓的培養(yǎng)基為MS+3.0mg/L2,4-D+2.5g/LKm。
　　以攜帶目的基因的根癌農(nóng)桿菌侵染無菌葉片,以5min為好,GUS瞬時(shí)表達(dá)率先升高后降低,最高為83.3%;對愈傷組織轉(zhuǎn)化的效率以10min侵染時(shí)間相對較好,GUS瞬時(shí)表達(dá)率為85%。共培養(yǎng)時(shí)間2d