柑橘基因組進化和果實采后轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、柑橘基因組學(xué)研究在理解基因組結(jié)構(gòu)特征及基因-性狀之間聯(lián)系等方面取得了飛速發(fā)展，并積累了大批的數(shù)據(jù)。本實驗室對甜橙基因組開展了denovo測序并獲得其基因組草圖。同時高通量分析技術(shù)也是研究柑橘響應(yīng)貯藏逆境脅迫、揭示果實采后生命活動規(guī)律的重要新興手段。本研究中，我們分別從基因組大小進化和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式等生物學(xué)角度出發(fā)解析這些序列數(shù)據(jù)和分子生理數(shù)據(jù)的屬性特征及相互關(guān)系，主要包括了四部分內(nèi)容:(1)分析柑橘轉(zhuǎn)座元件的組成、類別、進化模式、活性

2、和柑橘群體間的插入差異等;(2)研究全基因組復(fù)制在柑橘物種形成過程中發(fā)生的次數(shù)和時間，并通過共線性分析揭示柑橘染色體進化機制;(3)基于基因表達譜芯片解析椪柑低溫貯藏中生理變化的主要調(diào)控元件和關(guān)鍵功能模塊;(4)從結(jié)構(gòu)、生理代謝和基因表達等水平研究采后打蠟處理對椪柑果實線粒體的影響。主要結(jié)果如下:
　　1.柑橘轉(zhuǎn)座元件的注釋和進化特征
　　(1)轉(zhuǎn)座元件在甜橙和克里曼丁橘基因組序列中分別占18.38％和20.56％。其中反轉(zhuǎn)

3、錄轉(zhuǎn)座子在全部轉(zhuǎn)座元件序列中所占的比率為95％，而DNA轉(zhuǎn)座子儀占5％。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的Copia和Gypsy類型是含量最多的轉(zhuǎn)座元件類型，分別占40％和50％左右。
　　(2)在甜橙基因組中分析得到了1331條全長反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，并依據(jù)序列相似度將其歸于198個Copia家族和130個Gypsy家族;在克里曼丁橘基因組中得到2394條全長反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座了，將其歸于213個Copia家族和99個Gypsy家族。兩個基因組中的80％反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)

4、座子家族所含全長序列成員數(shù)都小于5個，表明這些家族有著較低的基因組擴增速率。而15個所含成員最多的家族分別占甜橙和克里曼丁橘基因組總序列的10％和13.9％。基于RT結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，Copia家族的擴增有著明顯的進化分支偏好性。
　　(3)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座予在甜橙和克里曼丁橘基因組中半衰期分別為0.67myr和0.55myr，且不同家族有著不同的擴增高峰期。
　　(4)部分反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族仍保留轉(zhuǎn)錄活性，并在塑造柑橘不同

5、品種基因組結(jié)構(gòu)中發(fā)揮了作用。
　　2.柑橘全基因組復(fù)制
　　(1)甜橙943個標(biāo)記的連鎖圖用于定位了161個denovo測序得到的scaffolds，總長為239Mb，含有的基因數(shù)目為22873個。
　　(2)在甜橙染色體1-2-4，3-4-6，3-5-9，5-7-8，4-6-8，1-4-7之間檢測到同源倍增區(qū)段，對應(yīng)著1321對同源基因。這些基因的Ks分布呈正態(tài)分布特征并只含有一個峰值(Ks=1.27)，推測在柑橘基

6、因組進化過程中只發(fā)生過古老的γ復(fù)制事件，而沒有發(fā)生新的全基因組復(fù)制。
　　(3)柑橘基因組和擬南芥、可可、蘋果、草莓、葡萄基因組共線性分析表明柑橘和可可、葡萄基因組有著較高的共線性關(guān)系，從而說明甜橙較好地保留了古老染色體狀態(tài)。而至少發(fā)生了49次重組和融合事件后導(dǎo)致柑橘染色體從古老雙子葉祖先的X=7狀態(tài)進化到現(xiàn)今X=9的染色體核型。
　　3.椪柑（CitrusreticulataBlanco）采后低溫貯藏轉(zhuǎn)錄組分析
　　

7、(1)椪柑表達譜芯片結(jié)果表明，低溫貯藏轉(zhuǎn)錄本中有2161個差異表達基因，包含了975個上調(diào)表達和1186個下調(diào)表達的基因。而表達改變主要發(fā)生在低溫貯藏60d以后。上調(diào)表達基因主要對應(yīng)了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，逆境脅迫應(yīng)答因子和激素信號等功能。
　　(2)有92個與激素相關(guān)的基因和98個轉(zhuǎn)錄因子表達水平發(fā)生了改變。其中乙烯信號途徑相關(guān)基因表達均上調(diào)，而AP2-EREBP和C2H2轉(zhuǎn)錄因子家族上調(diào)表達數(shù)日達到顯著水平。
　　(3)可溶性糖

8、（蔗糖，葡萄糖和果糖）變化模式都為貯藏前60d略有上升，而60d后下降。而相應(yīng)的蔗糖酶表達上升，淀粉水解酶表達下降。
　　4.椪柑（CitrusreticulataBlanco）采后低氧脅迫與線粒體功能的關(guān)系
　　(1)經(jīng)打蠟處理后的果實，乙醇和乙醛含量提高顯著;ATP和NADPH下降顯著;POD活性下降顯著;線粒體結(jié)構(gòu)變化明顯，表現(xiàn)為內(nèi)嵴消失，線粒體蛋白溢出等。
　　(2)對打蠟果實的代謝組分析得到50種代謝物，其中

9、有18種物質(zhì)含量變化顯著，包括有機酸，氨基酸，嘌呤，糖和糖衍生物等。
　　(3)通過同源序列法，我們獲得了400個線粒體定位蛋白，217個葉綠體定位蛋白，116個液泡定位蛋白和119個質(zhì)膜定位蛋白的相應(yīng)核苷酸序列信息，并與597柑橘轉(zhuǎn)錄因子一并設(shè)計探針，定制了一款含1569個基因的Agilent寡核苷酸芯片。
　　(4)在常溫(R)，打蠟常溫(WR)和打蠟低溫(WL)三種貯藏條件下，一共有474個差異表達基因;而這三種貯藏條

10、件對應(yīng)的差異基因數(shù)目分別為181，400和90，表明WR果實中基因表達變化最大。
　　(5)變化顯著的功能模塊中，NADH參與的ATP合成模塊、N代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等為上調(diào)表達模塊，而其余的多為下調(diào)表達功能模塊。
　　(6)在R，WR，WL貯藏條件果實中分別有68，180，70個差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括了AP2-EREBP，NAC，WRKY，C2H2，MYB-related家族等;其中AP2-EREBP和HB家族的部分成員與