比較基因組、轉(zhuǎn)錄組和基因功能研究揭示核盤菌致病和發(fā)育的分子機(jī)理.pdf

1、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一種寄主范圍廣泛、世界性分布的典型死體營(yíng)養(yǎng)型植物病原真菌，能夠在多種經(jīng)濟(jì)作物（例如油菜，向日葵，大豆和扁豆等）上引起菌核病，給農(nóng)作物生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　為了從基因組水平上研究核盤菌的發(fā)育特性，對(duì)核盤菌及已測(cè)序真菌的基因組進(jìn)行了功能注釋和功能基因組比較分析。發(fā)現(xiàn)核盤菌基因組中與轉(zhuǎn)座元件相關(guān)的類似CENP-B的DDE超家族核酸內(nèi)切酶和反轉(zhuǎn)錄酶要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其它真菌，這種

2、顯著的差異暗示了轉(zhuǎn)座事件在核盤菌基因組的進(jìn)化中起到了重要作用。進(jìn)一步詳細(xì)分析了核盤菌中的轉(zhuǎn)座元件的種類和它們與類似CENP-B的DDE超家族核酸內(nèi)切酶基因和反轉(zhuǎn)錄酶基因在基因組中的相對(duì)位置關(guān)系，表明這些酶家族基因的周圍確實(shí)存在典型的轉(zhuǎn)座元件。絕大多數(shù)類似于CENP-B的DDE超家族核酸內(nèi)切酶都與DNA轉(zhuǎn)座元件相關(guān)，其中TcMar-Fot1類群最多;所有反轉(zhuǎn)錄酶都與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件相關(guān)，其中LINE/Tad1，LTR/Gypsy和LTR/C

3、opia三個(gè)類群占比最多。對(duì)核盤菌及其它真菌中轉(zhuǎn)座元件的種類和數(shù)量的比較發(fā)現(xiàn)，DNA和RNA轉(zhuǎn)座元件均在核盤菌基因組的進(jìn)化過程中起著重要作用。系統(tǒng)發(fā)育分析揭示類似CENP-B的DDE超家族核酸內(nèi)切酶和反轉(zhuǎn)錄酶基因家族的擴(kuò)張可能是核盤菌中相應(yīng)轉(zhuǎn)座元件在進(jìn)化過程中短時(shí)間內(nèi)大量復(fù)制擴(kuò)增的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄分析表明盡管這兩大類轉(zhuǎn)座子中的大部分已經(jīng)“失活”，但少部分仍然具有“活性”，插入其它功能基因下游是其保持活性的方式之一。
　　利用數(shù)字表達(dá)譜檢

4、測(cè)了核盤菌在6個(gè)關(guān)鍵發(fā)育階段（包括菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段、侵染階段、菌核形成階段、菌核菌絲萌發(fā)階段、菌核子囊柄萌發(fā)階段和子囊柄形成階段）的轉(zhuǎn)錄組。為了從整體上闡述核盤菌不同功能模塊活性在各個(gè)發(fā)育階段的動(dòng)態(tài)變化，建立一種“功能譜”的分析方法來衡量各種功能模塊（例如GO功能模塊、Interpro功能模塊和KEGG代謝途徑）的相對(duì)活性。功能譜分析可以將基因表達(dá)水平和基因功能注釋結(jié)合起來描繪相應(yīng)功能模塊的相對(duì)活性。通過比較“功能譜”，明確了各個(gè)功能模

5、塊在核盤菌不同發(fā)育階段的相對(duì)活性的動(dòng)態(tài)變化。此外，利用基因功能富集分析法發(fā)現(xiàn)了核盤菌在不同發(fā)育階段相對(duì)菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段所富集到的多個(gè)功能模塊。
　　功能譜分析結(jié)果顯示一條不完整的碳固定相關(guān)通路在核盤菌侵染、菌核菌絲萌發(fā)和菌核子囊柄萌發(fā)過程中被顯著地激活。光合作用過程中植物的碳固定途徑是將太陽能轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)、生物產(chǎn)品和生物燃料的過程。對(duì)這條通路進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)大量的異養(yǎng)型真菌也擁有和植物碳固定途徑相關(guān)的各種酶類，其中的許多酶在真菌中

6、都是保守的。在異養(yǎng)型的核盤菌中存在17個(gè)植物碳固定途徑相關(guān)酶類的同源蛋白，在Calvin-Benson-Basham(CBB)還原型磷酸戊糖途徑中有10個(gè)，在C4-二羧酸循環(huán)中有7個(gè)。尤其是在CBB循環(huán)中，只有5-二磷酸羧化加氧酶(Rubisco)和磷酸核酮糖激酶(PRK)在核盤菌中找不到同源蛋白。RNAi沉默試驗(yàn)證明許多和這條途徑相關(guān)的酶類都在核盤菌的侵染和菌核形成過程中發(fā)揮重要作用。遺傳發(fā)育分析表明許多碳固定相關(guān)酶類在進(jìn)化中都經(jīng)歷了

7、基因復(fù)制、基因丟失或獲得和基因功能多樣化事件。這些發(fā)現(xiàn)在碳固定層面展示了自養(yǎng)型生物和異養(yǎng)型生物之間的聯(lián)系，表明在進(jìn)化過程中碳固定相關(guān)基因的功能在不同物種中是動(dòng)態(tài)變化的。
　　在核盤菌發(fā)育過程中，碳水化合物活性酶類相關(guān)的功能模塊也受到了顯著地誘導(dǎo)。比較基因組分析顯示死體營(yíng)養(yǎng)型和半活體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌的植物細(xì)胞壁降解酶和真菌細(xì)胞壁降解酶的數(shù)量都要比大多數(shù)活體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌中的多。然而，對(duì)核盤菌、禾谷鐮刀菌、青楊葉銹菌和禾谷類柄銹菌中的碳

8、水化合物活性酶類的轉(zhuǎn)錄分析表明在死體營(yíng)養(yǎng)型和活體營(yíng)養(yǎng)型真菌的侵染過程中，許多編碼植物細(xì)胞壁降解酶類的基因和真菌細(xì)胞壁降解酶類的基因都顯著上調(diào)表達(dá)，表明植物病原真菌中存在一種植物細(xì)胞壁降解和真菌細(xì)胞壁重組或修飾相伴隨的普遍機(jī)制，該機(jī)制可能與病原真菌的侵染密切相關(guān)。此外，本研究的結(jié)果表明植物病原真菌細(xì)胞壁的重組和修飾還與其自身的發(fā)育相關(guān)。
　　小分泌蛋白在活體半活體營(yíng)養(yǎng)型真菌和其寄主植物的互作中發(fā)揮了重要作用，然而對(duì)它們?cè)诩闹鞣翘禺愋?/p>

9、死體營(yíng)養(yǎng)型真菌中的作用還知之甚少。轉(zhuǎn)錄組分析顯示許多分泌蛋白編碼基因在核盤菌菌核形成和侵染過程中顯著上調(diào)表達(dá)。選取兩個(gè)在核盤菌侵染過程中顯著上調(diào)表達(dá)的富含半胱氨酸的小分泌蛋白，即SsCVNH和SsSSVP1進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诤吮P菌的致病過程中發(fā)揮重要作用。對(duì)SsSSVP1的進(jìn)一步研究表明，SsSSVP1從菌絲中被分泌出來后可被植物細(xì)胞內(nèi)化并且可在細(xì)胞間自主轉(zhuǎn)運(yùn)，這種轉(zhuǎn)運(yùn)不依賴于核盤菌本身。SsSSVP1主要定位于寄主的細(xì)胞質(zhì)并可誘

10、導(dǎo)植物細(xì)胞壞死。酵母雙雜交、免疫共沉淀和熒光雙分子互補(bǔ)試驗(yàn)均證實(shí)SsSSVP1與植物中蛋白QCR8互作，QCR8是植物線粒體呼吸鏈上細(xì)胞色素b-c1復(fù)合體中的一個(gè)亞基。雙定點(diǎn)突變結(jié)果表明兩個(gè)半胱氨酸殘基（C38和C44）同時(shí)突變使SsSSVP1不能形成同源二聚體，不能和QCR8互作并失去了誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死的能力，說明部分半胱氨酸殘基在維持SsSSVP1的結(jié)構(gòu)和功能過程中發(fā)揮了重要作用。熒光共定位試驗(yàn)和熒光雙分子互補(bǔ)試驗(yàn)顯示SsSSVP1

11、可以在QCR8進(jìn)入線粒體之前將其“劫持”到細(xì)胞質(zhì)中從而擾亂了QCR8的亞細(xì)胞定位。在煙草中進(jìn)行的病毒介導(dǎo)的基因沉默試驗(yàn)表明沉默QCR8導(dǎo)致植株發(fā)育異常且引起植物細(xì)胞的壞死反應(yīng)，提示SsSSVP1誘導(dǎo)的植物細(xì)胞壞死與SsSSVP1-QCR8之間的互作導(dǎo)致QCR8亞細(xì)胞定位的改變相關(guān)，QCR8亞細(xì)胞定位的改變可能使其喪失了生物學(xué)功能。這些結(jié)果表明小分泌蛋白在寄主非特異性死體營(yíng)養(yǎng)型真菌中也作為潛在的效應(yīng)因子發(fā)揮著重要作用。本研究揭示了小分泌蛋

12、白在寄主非特異性死體營(yíng)養(yǎng)型真菌和其寄主植物互作過程中的新功能，闡明這種互作類型的致病機(jī)制具有重要意義。
　　本文從基因組、轉(zhuǎn)錄組和分泌蛋白組等多個(gè)水平研究了核盤菌致病和發(fā)育的分子機(jī)制。本研究的結(jié)果表明核盤菌任何一個(gè)發(fā)育階段都是多個(gè)基因組成一個(gè)密切聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)協(xié)同起作用的，但是這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因所發(fā)揮的作用和所處的地位并不相同，存在某些關(guān)鍵的“節(jié)點(diǎn)基因”對(duì)某些生物學(xué)進(jìn)程起著決定性作用。本文結(jié)合核盤菌的數(shù)字表達(dá)譜和生物信息學(xué)方法一方面全