大腸桿菌轉(zhuǎn)錄因子和基因組多位點(diǎn)進(jìn)化提高生產(chǎn)性能的研究.pdf

1、大腸桿菌具有遺傳背景清楚、生長(zhǎng)迅速和培養(yǎng)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域最常用的宿主菌之一。本論文開展全局轉(zhuǎn)錄因子定向進(jìn)化技術(shù)和基因組多位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)化技術(shù)的研究，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌基因組上多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度或多個(gè)基因位點(diǎn)的同時(shí)操控，為菌種改良提供了新的思路。
　　本文首先通過進(jìn)化大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄因子，從而直接或間接的調(diào)控菌體在全基因組規(guī)模上的轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)現(xiàn)大腸桿菌菌種的改良。首先進(jìn)化大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄因子CRP提高大腸桿菌中番茄紅素的合成能

2、力。在10L罐上的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，含有A26T(D8V)的CRP突變子的大腸桿菌番茄紅素產(chǎn)量較對(duì)照菌株提高了25％。為闡明突變CRP提高大腸桿菌合成番茄紅素能力的機(jī)理，利用基因芯片技術(shù)測(cè)定突變菌株的全基因轉(zhuǎn)錄變化情況，和對(duì)照菌株比較發(fā)現(xiàn)突變菌株中有396個(gè)基因發(fā)生了差異表達(dá)，找到了可能影響菌體性狀和目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成能力的關(guān)鍵基因群。為了探索大腸桿菌中其它全局轉(zhuǎn)錄因子的作用，通過進(jìn)化另一個(gè)大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄因子FNR，將大腸桿菌對(duì)乙醇和丁醇的耐

3、受能力分別提高了30％和28％，驗(yàn)證了通過轉(zhuǎn)錄因子定向進(jìn)化實(shí)現(xiàn)菌株體內(nèi)多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度同時(shí)操控以改良菌株的可行性。
　　本文接著從分析基因組多位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)化技術(shù)的機(jī)理和操作入手，搭建了一套自動(dòng)化操作平臺(tái)，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)基因組自動(dòng)化進(jìn)化儀的研究空缺。該裝置通過上位機(jī)軟件程序自動(dòng)控制多軸機(jī)械手和多個(gè)儀器部件的協(xié)同運(yùn)作，完成了菌體培養(yǎng)、菌體收集、感受態(tài)細(xì)胞的制備、外源基因的添加和電轉(zhuǎn)化等多個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了多輪同源重組的自動(dòng)循環(huán)運(yùn)行。該裝置僅

4、需4小時(shí)即可完成一輪同源重組，自動(dòng)化連續(xù)運(yùn)行直至大腸桿菌基因組突變文庫構(gòu)建完成。
　　在此基礎(chǔ)上，開展了寡核苷酸介導(dǎo)的蛋白質(zhì)體內(nèi)進(jìn)化研究，以提高PQQGDH蛋白的熱穩(wěn)定性和底物特異性為目標(biāo)，通過對(duì)大腸桿菌基因組上pqqgdh基因的兩個(gè)三聯(lián)密碼子引入飽和突變，耦合顏色反應(yīng)的高通量篩選，得到PQQGDH蛋白熱穩(wěn)定性和底物特異性同時(shí)提高的菌株，其在55℃下的半衰期提高了4倍，底物特異性提高了50％左右。為降低突變基因庫的構(gòu)建成本，嘗試?yán)?/p>

5、用體外易錯(cuò)PCR制備雙鏈DNA構(gòu)建突變文庫，對(duì)基因組上的dxs基因進(jìn)行原位進(jìn)化提高大腸桿菌番茄紅素的合成能力。利用基于顏色的高通量篩選方法，獲得番茄紅素產(chǎn)量提高5倍以上的突變株，并通過基于HPLC的檢測(cè)方法測(cè)定DXS突變體的酶活。結(jié)果顯示DXS酶活提高是番茄紅素產(chǎn)量增加的直接原因，表明了雙鏈DNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)體內(nèi)進(jìn)化策略的建立。為提高突變基因庫的同源重組效率，開展了單鏈基因突變文庫的制備研究。通過兩步PCR法制備單鏈DNA突變庫，將同源

6、重組的效率提高到10％，是雙鏈DNA重組效率的100倍。制備得到的單鏈DNA進(jìn)一步以DNaseⅠ酶切，回收獲得90bp單鏈DNA作為突變文庫，將同源重組的效率提高到15％。利用此策略進(jìn)化基因組上的dxs基因，將大腸桿菌番茄紅素的合成能力提高了50％，建立了一個(gè)具有普遍意義的大腸桿菌基因組多位點(diǎn)快速進(jìn)化的策略。
　　總之，本文致力于大腸桿菌體內(nèi)多基因的同時(shí)操控以改良菌株性狀，建立了全局轉(zhuǎn)錄因子定向進(jìn)化和基因組多位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)化兩種技術(shù)手