乙烯誘導柑橘果實脫落的轉(zhuǎn)錄基因組學研究及乙烯誘導基因的克隆和鑒定.pdf

1、果實脫落是影響柑橘產(chǎn)量的重要因素之一。乙烯調(diào)節(jié)脫落過程中細胞分裂、伸長、細胞壁水解等多種細胞學、生物化學進程，是主要的脫落激素。乙烯生物合成途徑已經(jīng)闡明。研究指出，柑橘葉片和果實中都存在兩種乙烯生成系統(tǒng)，柑橘葉片在采摘后(老葉3-5天、新葉6-7天)乙烯合成表現(xiàn)為系統(tǒng)Ⅰ，老葉采后5天、新葉采后7天則表現(xiàn)出乙烯自動催化等典型的類似躍變型果實的乙烯生成系統(tǒng)Ⅱ的特征；柑橘作為一種非躍變型的果實，成熟果實中只有系統(tǒng)Ⅰ存在，外源乙烯能促進成熟相關(guān)

2、的色素變化加快呼吸進程；但在幼果中表現(xiàn)出乙烯生成系統(tǒng)Ⅱ類似的特征。為探尋乙烯在柑橘成熟果實脫落過程中的作用機理，本研究進行了乙烯誘導下柑橘果實離層的表達譜分析，柑橘PRP、ERF和半胱氨酸蛋白酶基因全長cDNA克隆、表達分析和柑橘PRP、ERF、半胱氨酸蛋白酶基因RNAi載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化等研究。
　　 1.乙烯誘導下柑橘果實離層的表達譜分析
　　 利用Citrus Genome Array研究了在外源乙烯(20μL/L)

3、誘導下柑橘果實離層的基因表達譜，在30395個達到探針對閥值(8對)要求的探針組中，檢測到20639探針組對應的基因表達。應用GCOS軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)管理、RMA進行數(shù)據(jù)預處理、隨機方差模型的單因素方差分析法分析實驗組與對照組間的差異基因之后，發(fā)現(xiàn)在FDR(false-discovery rate)≤0.02水平上乙烯處理4h、24h后分別有569和356條基因表達量的變化倍數(shù)≥4。其中，4h乙烯處理后表達量上調(diào)的有243條，處理24h

4、后上調(diào)表達的有176條；而對應時間內(nèi)表達量下調(diào)的則分別有326條和190條。分析了隨機挑選的16條基因，所得結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)高度一致。根據(jù)基因功能分類，發(fā)現(xiàn)這些乙烯應答基因涉及協(xié)迫應答、生物或非生物刺激、蛋白質(zhì)代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄等多種生物學過程。經(jīng)過基因本體(Gene Ontology,GO)分析，差異表達基因中，發(fā)現(xiàn)富含羥脯氨酸蛋白-4(PRP4，proline-fich protein4)基因、乙烯響應因子1(ERF1，e

5、thylene response factor1)基因和半胱氨酸蛋白酶(CysP,cysteine proteinase)基因高度受到乙烯調(diào)控，它們在柑橘果實脫落中所起的作用值得關(guān)注，因而被挑選出來進一步分析。
　　 2.柑橘CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP基因全長cDNA克隆和表達分析
　　 根據(jù)HarvEst Citrus(Version1.25)數(shù)據(jù)庫提供的CsPRP4、CsERF1、Cs

6、Unknow和CsCysP序列信息設(shè)計了PCR引物，采用RT-PCR和SMART RACE技術(shù)和克隆操作，獲得了這些基因的全長cDNA序列。
　　 序列分析結(jié)果顯示，這4個基因的全長cDNA長度分別是1251bp、1453bp、1545bp和1452bp，開放閱讀框(ORF)的長度分別是585bp、810bp、1101bp和1050bp，分別編碼194、269、365和347個氨基酸，相應的推測分子量分別是20.79KD、29.

7、25KD、41.6KD和38.4KD。蛋白理化性質(zhì)分析表明CsPRP4和CsERF1性質(zhì)穩(wěn)定，而CsUnknow和CsCysP不穩(wěn)定。
　　 生物信息學和基因差異表達分析表明：CsPRP4是受外源乙烯誘導表達量上升最強烈的編碼細胞壁蛋白的基因，在葉片和果實離層均表達，受乙烯誘導后的葉片和果實離層表達存在差異；CsERF1是AP2超基因家族成員，具轉(zhuǎn)錄因子活性，在乙烯誘導下表達量大量增加，CsERF作為乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑的中間組分，

8、具有結(jié)合GCC-box的活性，通過與乙烯應答基因啟動子中的GCC-box結(jié)合調(diào)控下游基因表達，可能是最終導致脫落的關(guān)鍵因子之一；CsUnknow基因，定位于內(nèi)膜系統(tǒng)，具有GCC-box結(jié)合域，受乙烯強烈誘導，功能未知；CsCysP蛋白，是重要的水解蛋白酶之一，具有肽鏈內(nèi)切酶活性，是一種跨膜蛋白，定位于液泡膜上。外源乙烯作用下，CsCysP在柑橘果實離層中受到強烈抑制，推測其負調(diào)控下游的脫落相關(guān)基因，受其作用的某些蛋白質(zhì)的積累可能是脫落過

9、程所必須的。
　　 3.柑橘CsPRP4、CsERF1和CsCysP基因RNAi載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
　　 采用RT-PCR方法擴增柑橘目的基因PRP4、ERF1和CysP的cDNA片段，連接到TA克隆載體。雙元載體pFGC5941和目的基因的克隆經(jīng)限制性內(nèi)切酶兩次雙酶切，將目的基因片段按正、反向插入到pFGC5941查耳酮合成酶內(nèi)含子的兩端，構(gòu)成反向重復序列，即RNA干涉載體。通過菌液PCR、酶切檢驗或測序等證實正、反向基

10、因片段均已正確插入到載體中。研究中保留了采用該法構(gòu)建的全長正向片段與pFGC5941相連接后得到的產(chǎn)物，以用于基因的過量表達研究。采用根癌農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因法得到了大量抗性芽，其中部分已經(jīng)嫁接成活，為下一步研究在干擾和過量表達這些基因后的表型打下了基礎(chǔ)。
　　 4.主要結(jié)論
　　 本實驗在轉(zhuǎn)錄水平上大規(guī)模地研究了外源乙烯誘導下柑橘果實離層的基因表達譜的變化，獲得了大量潛在的參與脫落進程的基因及其表達數(shù)據(jù)。在全面綜合分析這

11、些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，基本明確了參與脫落過程的生理生化過程，加深了對乙烯在誘導柑橘果實脫落過程中基因調(diào)節(jié)等分子機理的認識。
　　 克隆獲得了4條在柑橘果實脫落過程中受到強烈調(diào)控的基因CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP的全長cDNA。對這些基因進行了生物信息學分析，結(jié)合表達分析，推測了其在脫落過程中可能的作用。
　　 構(gòu)建了CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP基因的過量表達載體和RN