真核生物非逆轉(zhuǎn)錄病毒內(nèi)生化與進(jìn)化基因組學(xué)研究.pdf

1、病毒是地球上目前所知的最古老、數(shù)量最多、適應(yīng)性最強(qiáng)的生物實體(biologicalentities),代表著巨大、多樣的新基因源,病毒進(jìn)化因而很可能也影響到宿主的進(jìn)化。研究病毒進(jìn)化不僅可以了解病毒的多樣性,預(yù)測和解釋新病毒病的出現(xiàn),而且可以深入認(rèn)識病毒-宿主間的互作關(guān)系,揭示病毒-宿主之間遺傳信息的交流。病毒基因組比較是研究病毒互作與進(jìn)化的重要方式,但是常常會受到數(shù)據(jù)的限制,比如可用的病毒基因組數(shù)據(jù)量偏少,或著樣本不具代表性。更重要的是

2、,病毒沒有化石,病毒進(jìn)化研究只能局限在現(xiàn)存病毒上。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)能夠發(fā)生基因組整合,在數(shù)百萬年的進(jìn)化歷程中它們偶爾會內(nèi)生化(endogenization)到宿主基因組中形成內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(endogenous retroviruscs)。這些內(nèi)源病毒序列實際上代表著古老病毒基因組的“分子化石”,保留了古代病毒與宿主互作的重要信息,因此對研究病毒-宿主長期的互作與進(jìn)化歷史極為寶貴。此前一直認(rèn)為非逆轉(zhuǎn)錄病毒通常并

3、不能夠發(fā)生基因組整合,形成“病毒化石”的例子就更加罕見。
　　 本研究一方面立足于所在實驗室長期研究的核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)——一種重要植物病原真菌,從中分子克隆和測序分析未知真菌病毒的全基因組序列；另一方面立足于不斷增長的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫,運(yùn)用生物信息學(xué)方法和技術(shù),從公共的EST數(shù)據(jù)庫中電子克隆(cloning in silico)未知病毒的基因組序列,更重要的是,從真核生物基因組數(shù)據(jù)庫中挖

4、掘(data mining)作為“病毒化石”的內(nèi)源非逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。最后利用這些新得到的病毒基因組序列結(jié)合已有的相關(guān)病毒的數(shù)據(jù),在比較基因組學(xué)的框架內(nèi),以系統(tǒng)發(fā)育分析病毒基因和基因組序列為主要研究方式,全面了解病毒的多樣性、宿主范圍的廣泛性和非逆轉(zhuǎn)錄病毒內(nèi)生化現(xiàn)象,探討病毒內(nèi)生化機(jī)制、病毒起源進(jìn)化以及病毒-宿主在基因組水平上的互作關(guān)系,揭示病毒在真核生物進(jìn)化中的重要作用。本研究所取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.從核盤菌弱致病

5、力菌株gp-1PN中克隆到一種新RNA病毒,命名為核盤菌RNA病毒L(SsRV-L)。SsRV-L基因組全長6043 bp(不包括3’-末端的polyA尾),僅具單個開放閱讀框(ORF),編碼蛋白具有甲基轉(zhuǎn)移酶、RNA解旋酶和依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)保守結(jié)構(gòu)域。序列比較表明該蛋白與隸屬ss(+)RNA病毒“類甲病毒”超組的人類戊型肝炎病毒(HEV)的復(fù)制酶具有顯著相似性,這是首次在真菌中報道與人類病毒具有顯著親緣關(guān)系的ss(

6、+)RNA病毒。系統(tǒng)發(fā)育分析表明SsRV-L可歸于“類甲病毒"超組內(nèi)的“類風(fēng)疹病毒”世系,與植物長線形病毒(closteroviruses)、煙草花葉病毒(tobamoviruscs)、甜菜壞死黃脈病毒(bcnyviruscs)、昆蟲四病毒(tetraviruscs),以及脊椎動物戊型肝炎病毒(hepeviruses)和風(fēng)疹病毒(rubiviruses)都具有較近的親緣關(guān)系。并且這些病毒的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與宿主的分化相一致,表明其祖先可能起

7、源于宿主植物、真菌和動物分化之前,隨后在長期的進(jìn)化歷程中與宿主保持協(xié)同進(jìn)化,該發(fā)現(xiàn)對理解眾多的RNA病毒進(jìn)化世系的起源進(jìn)化以及新病毒的出現(xiàn)具有深遠(yuǎn)影響。另外,實驗證明了SsRV-L能夠在宿主核盤菌細(xì)胞內(nèi)獨立復(fù)制,對宿主生長速度和致病力可造成輕微的影響,進(jìn)一步明確了引起Ep-1PN菌株弱致病力的因為,對研究病毒介導(dǎo)的植物病原真菌弱毒特性的分子機(jī)理具有重要意義。
　　 2從核盤菌強(qiáng)致病力菌株Sunf-M中克隆到一種新單分體(mono

8、partits)dsRNA病毒,命名為核盤菌dsRNA真菌病毒L(SsMV-L)。SsMV-L基因組全長9124 bp,無polyA尾,具兩個長ORF(ORFl和ORF2),5’-非翻譯區(qū)相對較長(1088 bp)而3’-非翻譯區(qū)相對較短(54 bp)。ORF1推定編碼1304個氨基酸的蛋白,該蛋白具有磷酸庚糖異構(gòu)酶(Sugar ISomerase)保守結(jié)構(gòu)域的部分序列,但功能未知；ORF2推定編碼1337個氨基酸的蛋白,該蛋白具有RN

9、A病毒典型的RdRp保守結(jié)構(gòu)域,推測為病毒的復(fù)制酶。對SsMV-L及其相關(guān)的dsRNA病毒類群進(jìn)行了全面的系統(tǒng)發(fā)育分析和基因組結(jié)構(gòu)比較,研究結(jié)果表明SsMV-L代表一類新單分體dsRNA病毒世系,而單分體dsRNA病毒實際上具有多樣化的病毒世系,當(dāng)前的病毒分類系統(tǒng)已不能滿足需要,可考慮成立新的病毒科或在已有單分病毒科(Totiviridae)內(nèi)增加新屬以容納這些不同的病毒進(jìn)化世系。系統(tǒng)發(fā)育分析還表明基因組為4節(jié)段的產(chǎn)黃青霉病毒(chry

10、soviruscs)可能由單分體dsRNA病毒進(jìn)化而來。令人驚奇的是,SsRV-L復(fù)制酶RdRp結(jié)構(gòu)域的下游還具有植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)成員所特有的S7核心蛋白結(jié)構(gòu)域的同源序列,通過PSI-BLAST分析,發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域廣泛存在于多種RNA病毒類群中,包括產(chǎn)黃青霉病毒、內(nèi)源RNA病毒(endornaviruses)以及一些未歸類的單分體dsRNA病毒。結(jié)構(gòu)域排列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析表明S7結(jié)構(gòu)域序列可能起源于植物呼腸

11、孤病毒屬病毒,并且在不同種類的dsRNA病毒間發(fā)生過多次水平基因轉(zhuǎn)移事件。該發(fā)現(xiàn)首次證明遺傳關(guān)系非常疏遠(yuǎn)的dsRNA病毒類群間也能夠發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移事件,揭示了dsRNA病毒宏觀進(jìn)化(macroevolution)的分子機(jī)制。
　　 3.從核盤菌Sunf-M菌株中克隆到一種新雙分體(bipartite)dsRNA病毒,命名為核盤菌雙分病毒S(SsPV-S)。SsPV-S基因組包含大小相似的兩個片段:S-1和S-2,長度分別為18

12、56和1783 bp(不包括正鏈3’-末端的polyA尾),各含一個ORF,分別編碼病毒的RdRp和衣殼蛋白(CP)。對SsPV-S及目前已報道的雙分病毒(partitiviruses)進(jìn)行全面的系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果表明這些病毒主要形成4個單系類群。同一單系類群中可包括侵染真菌的雙分病毒(Partitivirus)和侵染植物的雙分病毒(Alphacryptovirus),表明雙分病毒可能在植物和真菌間發(fā)生過水平轉(zhuǎn)移,同時也說明當(dāng)前雙分病毒

13、科(Partitiviridae)的分類并不能反映病毒真實的進(jìn)化關(guān)系。值得說明的是,SsPV-S的CP蛋白與擬南芥生長素一亮氨酸抗性蛋白2(ILR2)具有最高的氨基酸相似性,而與其它雙分病毒的CP蛋白相似性都較低,表明病毒與擬南芥基因組之間可能發(fā)生過水平基因轉(zhuǎn)移事件。
　　 4.通過電子克隆技術(shù)從NCBI EST數(shù)據(jù)庫中克隆到120多條類似單分病毒、雙分病毒、產(chǎn)黃青霉病毒和內(nèi)源RNA病毒的新RNA病毒基因組序列,其中類似雙分病毒

14、的新病毒序列達(dá)到106條,幾乎使已知雙分病毒的種類翻了一倍。這些序列不僅代表先前未報道的病毒,而且很多來自新的宿主甚至新的宿主類群。例如許多類似單分病毒和內(nèi)源RNA病毒的序列來自動物,而目前這類病毒并未發(fā)現(xiàn)侵染動物。更重要的是,通過對這些新得到的病毒序列以及已報道的相關(guān)病毒序列進(jìn)行全面的系統(tǒng)發(fā)育分析,揭示了這些病毒與宿主的互作與進(jìn)化關(guān)系,即這些病毒的祖先可能起源于真核宿主超群(supergroup)分化之前,在漫長的進(jìn)化歷史中與宿主協(xié)同

15、進(jìn)化并伴隨頻率的宿主轉(zhuǎn)移事件。該研究證明電子克隆方法具有發(fā)現(xiàn)新病毒的巨大潛力,通過該方法的運(yùn)用極大地增強(qiáng)了我們對dsRNA病毒多樣性、宿主范圍廣泛性以及病毒一宿主互作與進(jìn)化的認(rèn)識。
　　 5.通過對dsRNA病毒和真核生物基因組進(jìn)行系統(tǒng)地數(shù)據(jù)比較,鑒定真核基因組中內(nèi)源dsRNA病毒序列,研究結(jié)果表明單分病毒和雙分病毒都存在廣泛的內(nèi)生化現(xiàn)象。總共從來自植物、節(jié)肢動物、真菌、線蟲、腹足動物和原生動物等類群的20多種真核生物的核基因組

16、中鑒定出22個類似雙分病毒和34個類似單分病毒RdRp或CP基因的序列。通過PCR擴(kuò)增、測序以及計算分析證明這些序列是真正存在于真核生物基因組中的內(nèi)源病毒序列。序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步證明這些序列來自單分病毒和雙分病毒的內(nèi)生化。鑒于許多內(nèi)源病毒序列來自目前還未報道被單分病毒和雙分病毒侵染的真核類群,本研究延伸了這些病毒的宿主范圍。另外,通過分析內(nèi)源病毒基因的保守性和表達(dá)情況,證明一些內(nèi)源病毒基因,例如擬南芥和白菜(Brassica

17、rapa)基因組中的雙分病毒CP類似基因和果蠅(Drosophila grimshawi)基因組中的雙分病毒RdRp類似基因不僅存在序列保守性而且能夠表達(dá),尤其是擬南芥中的CP類似基因(ILR2)已被證明具有調(diào)節(jié)植物激素吲哚乙酸生物合成的功能。本研究提供翔實的證據(jù)證明dsRNA病毒的遺傳材料可以水平轉(zhuǎn)移到多樣的真核生物基因組中,并可能產(chǎn)生有重要功能的新基因,表明RNA病毒在真核生物進(jìn)化中扮演了重要角色。
　　 6.通過對線性ss

18、DNA病毒和真核生物基因組進(jìn)行系統(tǒng)地數(shù)據(jù)比較,鑒定真核基因組中內(nèi)源線性ssDNA病毒的序列,研究結(jié)果表明細(xì)小病毒(parvoviruses)和濃核病毒(densoviruses)都存在廣泛的內(nèi)生化現(xiàn)象?？偣矎膩碜圆溉閯游?、鳥類、魚類和背囊動物等類群的37種真核生物核基因組中鑒定出62個細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)類似序列和77個CP類似序列；從來自甲殼綱、蛛形綱和昆蟲綱動物以及扁形蟲等類群的9種真核生物核基因組中鑒定出92個濃核病毒NS類

19、似序列和44個CP類似序列。通過PCR擴(kuò)增、測序以及計算分析證明這些序列是真正存在于真核生物基因組中的內(nèi)源病毒序列。值得說明的是魚類、背囊動物和扁形蟲當(dāng)前并未發(fā)現(xiàn)被細(xì)小病毒侵染,但其基因組中存在內(nèi)源病毒序列清楚的表明它們被或曾經(jīng)被相關(guān)病毒侵染。序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析證明許多內(nèi)源病毒序列非常古老,至少在動物基因組中存在了數(shù)百萬年。特別是在人類和其它哺乳動物的基因組中鑒定出一個類似細(xì)小病毒CP基因的直系同源(orthologous)序列,表

20、明細(xì)小病毒與哺乳動物宿主共存至少有9,800萬年的歷史,此類病毒的進(jìn)化時間超出前人想象,同時,這也是迄今發(fā)現(xiàn)的最古老的“病毒化石”。另外,通過表達(dá)分析證明部分內(nèi)源細(xì)小病毒基因在真核生物基因組中可以表達(dá),表明細(xì)小病毒可能作為宿主未曾預(yù)料的遺傳革新源(source of genetic innovation)?？傊?內(nèi)源細(xì)小病毒和濃核病毒的發(fā)現(xiàn)提供了表征病毒入侵的“化石記錄”,從而有助于揭示其與宿主的進(jìn)化歷史,增強(qiáng)了我們對病毒一宿主互作的認(rèn)

21、識。
　　 7.通過對環(huán)形ssDNA病毒和真核生物基因組進(jìn)行系統(tǒng)地數(shù)據(jù)比較,鑒定真核基因組中類似環(huán)形ssDNA病毒的序列,研究結(jié)果表明類似雙生病毒(geminiviruses)、矮縮病毒(nanoviruses)和圓環(huán)病毒(circoviruses)的內(nèi)源序列廣泛存在于真核生物核基因組中?？偣矎膩碜哉婢⒅参锖驮鷦游锏阮惾旱?2種真核生物核基因組中鑒定出31個雙生病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)類似序列和1個CP類似序列；從來自綠藻

22、類、硅藻類、脊椎動物和無脊椎動物等類群的23種真核生物核基因組中鑒定出271個圓環(huán)病毒和矮縮病毒Rcp類似序列和2個CP類似序列。通過PCR擴(kuò)增、測序以及計算分析證明這些序列是真正存在于真核生物基因組中的內(nèi)源病毒序列。通過將這些內(nèi)源病毒序列與已知的環(huán)狀ssDNA病毒以及真核或原核滾環(huán)復(fù)制質(zhì)粒進(jìn)行序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析,不僅揭示了環(huán)狀ssDNA病毒的多樣性和宿主范圍的廣泛性,而且重構(gòu)了這些病毒與宿主長期的進(jìn)化歷史,并對雙生病毒、矮縮病毒和