淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628合成豐加霉素關(guān)鍵基因的研究.pdf

1、豐加霉素（Toyocamycin，TM）是核苷類抗生素家族中的一員。它在抑制真菌方面表現(xiàn)出很高的活性，在植物病害防治領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力。本論文針對(duì)TM生產(chǎn)菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）1628產(chǎn)量低等問(wèn)題，克隆了涉及S. diastatochromogenes1628豐加霉素生物合成的多個(gè)功能基因，利用代謝工程手段有效提高了S. diastatochromogenes1628

2、的豐加霉素的合成水平。
　　首先，以S. diastatochromogenes1628 DNA為模板，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，克隆得到參與TM生物合成大小分別為1443 bp的toyF（編碼腺苷酸琥珀酸裂解酶）（GenBank登錄號(hào)：JQ267374）和1284 bp的toyG（編碼腺苷琥珀酸合成酶）基因（GenBank登錄號(hào)：KF517415），其分別與已公布的多株鏈霉菌對(duì)應(yīng)基因的氨基酸序列具有很高的相似性，其中與S. venezuel

3、ae ATCC10712的氨基酸序列同源性最高，分別為90％和95%。將toyF和toyG基因分別置于鏈霉菌整合型載體 pIB139中的PermE*啟動(dòng)子下游，構(gòu)建了重組載體 pIB139-toyF和pIB139-toyG，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移法獲得重組菌1628-TOYF和1628-TOYG。將原始菌株1628與重組菌1628-TOYF、1628-TOYG進(jìn)行TM發(fā)酵、酶活分析及細(xì)胞干重檢測(cè)。重組菌中的TM產(chǎn)量和相應(yīng)的酶活TOYF(TOYG)

4、均高于原始菌。其中，重組菌1628-TOYG TM產(chǎn)量增幅最高達(dá)26.2%。
　　其次，以S. diastatochromogenes1628 DNA為模板，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，克隆了大小為558bp編碼核糖體再循環(huán)因子frr基因，其與Streptomyces flavogriseus ATCC33331、Streptomyces venezuelae ATCC10712和Streptomyces sp. NRRL F-2580菌株的F

5、rr氨基酸序列同源性最高，分別為92%、92%和89%。在S. diastatochromogenes1628中過(guò)量表達(dá)了frr基因，獲得重組菌1628-FRR（整合pIB139-frr）。1628-FRR與原始菌株1628發(fā)酵性能相比，TM產(chǎn)量增加了41.1%，細(xì)胞干重增長(zhǎng)了21%，發(fā)酵時(shí)間從84 h縮短至72 h。通過(guò)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與原始菌株1628相比，重組菌1628-FRR中基因toyF和toyG轉(zhuǎn)錄水平均有提高，且基因

6、toyG轉(zhuǎn)錄水平增加更為明顯。另外，利用基于綠色熒光蛋白（GFP）的熒光強(qiáng)度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，frr基因的過(guò)量表達(dá)能加速蛋白合成，發(fā)酵過(guò)程中后期此效果尤為顯著，從而導(dǎo)致TM產(chǎn)量的提高。
　　最后，將toyG基因分別與frr以及編碼透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin）的vgb基因串聯(lián)，以及三基因串聯(lián)表達(dá)考察對(duì)1628菌株合成TM的影響。發(fā)酵結(jié)果顯示，在構(gòu)建的多株重組菌中，vgb、frr和toyG基因分別置于