番茄SlAMSH3基因果實特異過表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)在植物生長發(fā)育過程中，包括激素合成、自交不親和、感知下游信號傳導(dǎo)、植物形態(tài)建成、抗病、表觀遺傳等過程都發(fā)揮重要作用。此外，細(xì)胞內(nèi)還有另一類起反向調(diào)節(jié)解離泛素鏈分子的去泛素化蛋白酶。AMSH3酶就是去泛素化酶家族中MPN(+)/JAMM()蛋白酶家族的一員，能結(jié)合泛素化蛋白上的泛素分子，通過水解泛素分子羧基末端的酯鍵，肽鍵或異肽鍵，從連有泛素的蛋白底物或者

2、前體蛋白上將泛素分子特異地脫離出來，重新進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)蛋白調(diào)節(jié)的循環(huán)中。去泛素化酶對植物的生長發(fā)育和生理過程很重要，但是目前人們對泛素和去泛素化酶的相關(guān)研究還很少。
　　本研究在番茄中發(fā)現(xiàn)了一去泛素化酶基因，lAMSH3，通過Sol GenomicsNetwork網(wǎng)站生物信息比對，發(fā)現(xiàn)番茄SlAMSH3基因與擬南芥去泛素化酶基因AtAMSH3在核酸水平和蛋白水平分別有81％和71％的相似性。在擬南芥中，去泛素化酶AtAMSH3是生長素

3、調(diào)節(jié)因子PIN2進(jìn)行高效細(xì)胞內(nèi)吞作用所必須的，能水解植物體外和體內(nèi)積累的K48-和K63-兩種泛素鏈，影響植物液泡的形成和液泡蛋白的運輸途徑。而amsh3突變體植株不僅不能形成中央裂解大液泡和積累吞噬體，還會將液泡蛋白錯誤分類運輸?shù)郊?xì)胞間隙中。分子克隆中，使用果實特異性表達(dá)啟動子TFM7比使用CaMV35S等組成型啟動子效果更佳。因此，本研究構(gòu)建了SlAMSH3果實特異過表達(dá)載體pBI121-TFM7-SlAMSH3和融合報告基因的表達(dá)

4、載體pART27-35s-SlAMSH3-GFP，并將pBI121-TFM7-SlAMSH3載體轉(zhuǎn)化到野生型番茄中，經(jīng)篩選獲得SlAMSH3在果實中高表達(dá)陽性株系，通過半定量RT-PCR分析和熒光定量PCR分析植株SlAMSH3基因表達(dá)水平，將pART27-35s-SlAMSH3-GFP載體在煙草中瞬時表達(dá)，通過融合報告基因定位法對SlAMSH3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，并測定綠熟期果實葉綠素含量及紅熟期果實的單果重量、果實糖度、果實硬度、番

5、茄紅素含量和β-胡蘿卜素含量，初步分析SlAMSH3基因?qū)Ψ哑焚|(zhì)的影響。
　　本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因番茄植株的果實中SlAMSH3基因表達(dá)水平提高了4倍，且SlAMSH3蛋白只在細(xì)胞核中表達(dá);轉(zhuǎn)基因番茄果實的葉綠素總含量、番茄紅素和β-胡蘿卜素比野生型分別提高178.61％，40.53％和74.86％，而轉(zhuǎn)基因番茄果實的單果重量、果實糖度、果實硬度及果實直徑等其他指標(biāo)沒有顯著性差異。因此，SlAMSH3果實特異過表達(dá)的方法能夠改