番茄果實(shí)SPS反義表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、本研究通過(guò)構(gòu)建番茄蔗糖磷酸合成酶反義表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄植株，得到的主要研究結(jié)果如下： 1.將保存在pMD18-T載體上的番茄蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段用HincII和XbaI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后用回收試劑盒回收約830bp的片段，即目的基因TSPS。經(jīng)HincII、XbaI酶切得到目的基因TSPS片段和經(jīng)XbaI、SmaI酶切得到的質(zhì)粒pROK3用T4DNA連接酶連接后，用熱激法轉(zhuǎn)化大

2、腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化得到的陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，都得到大小約為830 bp的片段，與目的片段大小吻合，說(shuō)明番茄蔗糖磷酸合成酶基因片段TSPS已反向連接到植物表達(dá)載體pROK3上，構(gòu)建了反義表達(dá)載體Anti-TSPS。 2.通過(guò)番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化試驗(yàn)，確定番茄自交系中雜9號(hào)的最佳分化培養(yǎng)基為MS+ZT2.0 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。再生苗經(jīng)過(guò)培養(yǎng)室內(nèi)煉苗一周左右直接定植田間，

3、可以充分保證其成活率。 3.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄子葉，共獲得135株番茄再生植株。用CTAB法分組提取葉片DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，有兩組擴(kuò)增到目的條帶，大小為830 bp。然后分別對(duì)這兩組單株提DNA鑒定共得到2株轉(zhuǎn)化植株，對(duì)這兩棵轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行PCR-Southern blot分析，擴(kuò)增到的目的片段均有雜交信號(hào)，說(shuō)明Anti-TSPS基因已經(jīng)整合到番茄植株中，排除了假陽(yáng)性的可能，且在番茄植株中的轉(zhuǎn)化率為1.4％。 4.通