BMP15基因?qū)q山羊mGSCs增殖分化的影響.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（Bone morphogenetic protein15，BMP15）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）超家族成員，早期研究認(rèn)為BMP15只特異性的在卵母細(xì)胞中表達(dá)，對雌性動物的繁殖力有重要的調(diào)控作用。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在一些物種的垂體、下丘腦、睪丸及其他組織中發(fā)現(xiàn)有BMP15表達(dá)，提示BMP15可能調(diào)節(jié)其他組織的發(fā)育。但目前對BMP15在卵巢上的功能作用研究較多

2、，而在垂體、下丘腦、睪丸及其他組織中的功能作用研究較少。本研究通過BMP15基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測，過表達(dá)BMP15對mGSCs增殖和分化的影響，為進(jìn)一步研究BMP15蛋白的功能及其在睪丸發(fā)育中的功能作用提供參考。本研究主要獲得以下結(jié)果：
　　1.采用混合酶消化、差速貼壁的方法分離純化了陜北白絨山羊mGSCs。差速貼壁培養(yǎng)7d后經(jīng)AKP染色，發(fā)現(xiàn)陽性克隆約占60％，經(jīng)CD49f和Oct4免疫組織化學(xué)染色后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞CD4

3、9f和Oct4大量表達(dá)，表明得到mGSCs純度較高。懸滴培養(yǎng)未分化mGSCs，發(fā)現(xiàn)擬胚體(EBs)出現(xiàn)，將EBs貼壁培養(yǎng)7d后，發(fā)現(xiàn)有脂肪、成骨和軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，確定體外培養(yǎng)的陜北白絨山羊mGSCs有較好的分化潛能。
　　2.運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件分析BMP15基因序列及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能表明，山羊BMP15基因編碼區(qū)長1185bp，編碼394個氨基酸，其基因序列及蛋白序列與綿羊、牛的同源性分別為99％和98％，親緣關(guān)系近。根據(jù)信

4、號肽分析，預(yù)測出在25和26位氨基酸之間可能存在最佳剪切位點(diǎn)，D值為0.815，提示BMP15蛋白可能是生長因子，屬于分泌性蛋白，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。利用Smart在線網(wǎng)站程序?qū)MP15蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析，表明BMP15有TGFβ功能結(jié)構(gòu)域，位于293-394氨基酸區(qū)域。利用ProtFun在線網(wǎng)站程序?qū)MP15蛋白功能預(yù)測，得到山羊BMP15具有細(xì)胞外被膜功能的可能性最大，達(dá)到12.822，推測其合成后可能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外膜上進(jìn)

5、行功能反應(yīng)。基因本體范疇分析發(fā)現(xiàn)，BMP15作為激素在生理活動中傳遞信息的可能性最大。
　　3.通過RT-PCR檢測BMP15在成年絨山羊不同組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)BMP15在公羊睪丸、十二指腸、瘤胃等組織上均有一定量的表達(dá)，因此推測BMP15在睪丸等組織生理過程中有調(diào)節(jié)作用。在mGSCs中過表達(dá)BMP15后發(fā)現(xiàn)c-Kit表達(dá)量有所增加，PLZF表達(dá)量有所降低，但均與對照組差異不顯著(P＞0.05)，推測BMP15對mGSCs增殖分