利用TALENs技術(shù)制備METN基因敲除的阿爾巴斯絨山羊.pdf

1、肌肉生成抑制素(Myostatin，MSTN)是骨骼肌生長發(fā)育的一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族的成員之一，具有抑制肌肉分化和生長的作用。研究表明通過遺傳操作降低MSTN基因的表達(dá)能加速肌肉生長并增加產(chǎn)肉量。本研究首先構(gòu)建了針對(duì)MSTN基因的TALENs載體，并利用標(biāo)記蛋白表達(dá)載體優(yōu)化了絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染條件，然后利用最優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件將TALENs載體導(dǎo)入阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，挑取轉(zhuǎn)

2、染后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，建立單克隆細(xì)胞系，通過PCR鑒定篩選出MSTN+/-和MSTN-/-兩種基因型的細(xì)胞系。選擇MSTN-/-基因型的細(xì)胞通過體細(xì)胞核移植(Somatic cell nuclear transfer，SCNT)的方法制備胚胎，移植受體后生產(chǎn)基因敲除的絨山羊。
　　1、絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞共轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
　　利用脂質(zhì)體法將紅色熒光蛋白表達(dá)載體pCMV-DsRed質(zhì)粒和綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1質(zhì)粒共

3、同導(dǎo)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，篩選最優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件。在轉(zhuǎn)染48h后，倒置熒光顯微鏡下可以觀察到大量表達(dá)紅色熒光和綠色熒光的陽性細(xì)胞并且細(xì)胞生長狀態(tài)良好。通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)最高的共轉(zhuǎn)染率為24.5％。對(duì)應(yīng)的最優(yōu)共轉(zhuǎn)染條件為:每1×105個(gè)絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞加入脂質(zhì)體3μL，pCMV-DsRed和pEGFP-C1的質(zhì)粒量各250ng。
　　2、利用TALENs技術(shù)制備MSTN基因敲除絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞
　　本實(shí)驗(yàn)采用

4、“單元組裝法”通過酶切連接將四單元模塊和三單元模塊進(jìn)行拼接，成功構(gòu)建出一對(duì)TALENs載體。采用最適的轉(zhuǎn)染條件，將TALENs載體bMK（包括S1586-PEAS、S1586-PERR兩個(gè)質(zhì)粒）導(dǎo)入阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，隨機(jī)挑取單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，建立單克隆細(xì)胞系。設(shè)計(jì)橫跨打靶位點(diǎn)的引物對(duì)每個(gè)單克隆細(xì)胞系的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，篩選出靶位點(diǎn)發(fā)生突變的單克隆細(xì)胞系。本研究共進(jìn)行了三次打靶實(shí)驗(yàn)，共獲得160個(gè)單克

5、隆細(xì)胞系，其中有20個(gè)單等位基因敲除和3個(gè)雙等位基因敲除的陽性單克隆細(xì)胞系，總敲除效率為14.38％。選取其中一株雙等位基因敲除細(xì)胞系D4進(jìn)行染色體數(shù)目分析，檢測(cè)正常率為90％(27/30)。本研究選擇D4細(xì)胞系作為供體細(xì)胞通過體細(xì)胞核移植的方法生產(chǎn)MSTN基因敲除絨山羊。
　　3、MSTN基因敲除絨山羊的生產(chǎn)
　　取屠宰山羊卵巢，切割法采卵，體外培養(yǎng)18h，利用盲吸法去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，分別將MSTN-/-型和WT型細(xì)胞

6、系作為供體細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞中，融合、激活后進(jìn)行體外發(fā)育培養(yǎng)。我們采用電融合法進(jìn)行融合，融合率分別為74.59％、71.2％;用IA23187和6-DMAP進(jìn)行融合卵的激活，用發(fā)育液進(jìn)行體外培養(yǎng)，48h后統(tǒng)計(jì)卵裂率分別為65.54％、65.9％。本研究通過體細(xì)胞核移植技術(shù)共獲得738枚MSTN-/-型重構(gòu)胚胎和723枚WT型重構(gòu)胚胎。將其中363枚卵裂的MSTN-/-克隆胚胎通過手術(shù)法移植入自然發(fā)情第三天的84只受體母羊的輸卵管中。