人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊中抗性基因刪除的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動物是通過遺傳工程手段對動物基因組的結(jié)構(gòu)或組成進行人為的改造,并使改造后的基因在世代間可以傳遞和表達的動物.大部分轉(zhuǎn)基因動物制備過程中不可避免的會使用來源于病毒或細菌的抗性基因,這些序列對目的基因的表達、受體動物以及轉(zhuǎn)基因生物的安全等帶來復(fù)雜的負面影響.為消除這些不利因素,本文以整合有l(wèi)oxP-neo-tk-loxP框架(LNKL)的轉(zhuǎn)基因山羊耳成纖維細胞(Goat ear fibroblast,GEF)為研究對象,探索了通過Cr

2、e/loxP系統(tǒng)刪除抗性基因的可行性,建立一套安全、高效的刪除轉(zhuǎn)基因山羊體內(nèi)外源冗余序列的技術(shù)體系. 首先,我們分離了乳汁內(nèi)表達人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山羊GEF(GEF-BLG-1和GEF-BLG-2),細胞大小、形態(tài)等未發(fā)現(xiàn)異常,抗性基因保留完整.通過電轉(zhuǎn)和脂質(zhì)體兩種轉(zhuǎn)染方法發(fā)現(xiàn),pBSl85質(zhì)粒在GEF內(nèi)的瞬間表達Cre重組酶能夠引發(fā)LNKL的刪除,但效率僅為O.8﹪,在挑取的515個克隆中,最后經(jīng)PCR鑒定為抗性基因刪除的細胞克

3、隆只有4個.更重要的是所挑克隆,細胞老化嚴(yán)重,無法用于后續(xù)核移植以制備轉(zhuǎn)基因山羊. 隨后,本文探索了通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)Cre重組酶的方法刪除抗性基因的可能性.包含有pET-cre質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DES),經(jīng)O.1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)3h后,表達了CRET<'TAT>,最高約占菌體總蛋白的48.6﹪.根據(jù)Cre重組酶的PI值約為10.3的特性,我們通過SP sepharose<'TM>和Sotlrce 15s兩步陽離子交換

4、色譜純化出CRE<'TAT>, SDS-PAGE為單一條帶.純化的CRE<'TAT>經(jīng)進一步緩沖液替換后進行體外活性測定,結(jié)果表明該蛋白能夠有效將線形的pLNKL內(nèi)的同向loxP位點間隔的序列切除. 將純化的CRE<'TAT>與GEF-BLG-2體外共同孵育,以介導(dǎo)GEF-BLG-2內(nèi)DNA重組,刪除LNKL序列.2μM CRE<'TAT>處理細胞,通過培養(yǎng),挑克隆,G418敏感性實驗,PCR鑒定以及Southern_blot鑒

5、定,最終獲得抗性基因刪除的且保留了人溶菌酶基因表達框架的單細胞克隆.抗性基因刪除效率為42﹪.另外,所得細胞克隆在增殖速度、形態(tài)、大小等方面,均與未處理細胞無明顯差異.最后,為評估CRE<'TAJ> 的處理是否會影響體細胞克隆重構(gòu)胚的發(fā)育潛能,我們將所得細胞進行體細胞核移植研究.研究發(fā)現(xiàn),在融合率(O.88)、回收包埋卵率(O.78)以及囊胚發(fā)育率(0.30)等方面,CRE<'TAJ>處理過的細胞均不低于未處理組(分別為O.64,O.5