畢赤酵母異源表達(dá)玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶及其酶學(xué)特性與功能的研究.pdf

1、玉蜀黍赤霉菌(Gibberellazeae)，以它的無性型孢子禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)而著名，它是一種植物病原菌，能夠引起大規(guī)模毀滅性的作物疾病，如小麥、大麥的赤霉病和玉米的穗腐病等。在感染赤霉病的小麥和感染穗腐病的玉米細(xì)胞內(nèi)，赤霉病原菌可以產(chǎn)生兩種霉菌毒素，引起消化道反應(yīng)、肝損傷和家畜生殖缺陷，嚴(yán)重危害人類健康。在菌絲體滲透過程中，赤霉菌體會產(chǎn)生細(xì)胞壁溶解酶，其中包括β-葡聚糖。人們認(rèn)為，β-葡聚糖酶作為

2、一種細(xì)胞壁修飾酶能夠很好地分解β-葡聚糖和其他多糖組分，使其更容易降解，開始得到人類的廣泛關(guān)注。
　　內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶在纖維素的水解過程中起著非常關(guān)鍵的作用，它能夠作用于纖維素鏈內(nèi)的β-1,4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子水解成更小分子量的葡萄糖聚合物。在原核生物和真核生物中，纖維素酶已經(jīng)形成一個(gè)大的家族體系并表現(xiàn)出不同的特性。在本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的基因序列（Genbank編號為

3、ESU17701），根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，通過PTDS方法合成了適合于在甲醇畢赤酵母系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)的玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶(GzeglAI)基因，并將載有目的基因的酵母表達(dá)載體YR1730，電擊轉(zhuǎn)化入甲醇型畢赤酵母GS115菌株體內(nèi)進(jìn)行分泌表達(dá)，通過后期的活性鑒定、SDS-PAGE電泳等方法，獲得能夠表達(dá)玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的陽性酵母菌株。將獲得的陽性畢赤酵母重組菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組β

4、-1,4-葡聚糖酶，粗酶液經(jīng)鎳柱純化后，進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)特性和動力學(xué)參數(shù)等的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明：GzeglAI的相對分子大小為27.17 kDa，蛋白定量為12.37μg/mL，等電點(diǎn)為7.75。酶的最適溫度是40oC，最適pH為4.5；當(dāng)把酶GzeglAI置于4oC，24 h處理后，其在酸性pH下表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性，特別是在pH4.0-6.5的活性高于80％；研究溫度穩(wěn)定性時(shí)，把酶液在不同溫度下處理不同時(shí)間顯示，在50oC時(shí)處理半小時(shí)可保

5、持初始酶活的30%，而當(dāng)溫度達(dá)到60oC時(shí)酶活急速下降，最終完全失活為零，所以此酶的熱穩(wěn)定性較差，并不耐高溫；本實(shí)驗(yàn)還探究了高低（1 mM和10 mM）兩種濃度的不同金屬離子對酶活性的影響，研究發(fā)現(xiàn)低濃度的Mn2+、高濃度的Mn2+和Cu2+對酶活有抑制作用，Cu2+抑制力較強(qiáng)，而高濃度的Al3+卻極大程度地促進(jìn)了該酶活反應(yīng)；選取羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、脫脂棉、濾紙和結(jié)晶纖維素(<6%)等不同纖維素類物質(zhì)進(jìn)行底物特異性的反應(yīng)研究

6、，結(jié)果顯示該酶對底物羧甲基纖維素鈉有較強(qiáng)的專一性，其Km值為73.92 g/L，Vm值為0.16 g/（L.min)；同時(shí)也研究了兩種蛋白消化酶如胃蛋白酶(pepsin)和胰蛋白酶(trypsin)對GzeglAI活性的影響，結(jié)果顯示胃蛋白酶對酶活性有一定程度的抑制作用，相反地，胰蛋白酶卻對酶促反應(yīng)無任何研究影響。根據(jù)SWISS-MODEL網(wǎng)站的PDB數(shù)據(jù)庫資源比對分析，選取4h7m.1.A（ThEG3）為模板進(jìn)行同源性建模，兩者相似度

7、高達(dá)58.72%；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，此β-1,4-葡聚糖酶屬于糖基水解酶第12家族中，其三個(gè)催化殘基Asp120、Glu137和Glu221在進(jìn)化中是嚴(yán)格保守的。
　　鑒于目前缺乏玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過畢赤酵母分泌表達(dá)玉蜀黍赤霉菌的β-1,4-葡聚糖酶基因，研究該β-1,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)與功能，不僅為闡述β-1,4-葡聚糖酶在玉蜀黍赤霉菌發(fā)育進(jìn)程及致病機(jī)理中所起的作用提供理論依據(jù)，并且為玉蜀黍赤霉菌β