豬單倍體孤雌胚胎和體外受精胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的研究.pdf

1、從基因組大小、代謝生理和個體大小來看,豬是最接近人類的哺乳動物。以豬為研究對象,進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的研究,可以為人類疾病研究和治療提供借鑒。單倍體孤雌胚胎干細(xì)胞或類胚胎干細(xì)胞系的成功建立,可實(shí)現(xiàn)雌性基因組的復(fù)制(即卵子克隆),從而為治療人類由配子發(fā)生障礙導(dǎo)致的不孕不育疾病提供有效途徑,同時也可能成為研究基因組印跡以及提高克隆動物生產(chǎn)效率的主要工具。體外受精(IVF)胚胎干細(xì)胞或類干細(xì)胞系的建立,不但可以用于研究人類器官病變或損傷的細(xì)胞移

2、植治療和藥物的細(xì)胞代謝水平篩選,還可以為基因敲除介導(dǎo)的動物轉(zhuǎn)基因育種提供靶細(xì)胞。
　　 本研究主要探討不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)液和小分子化合物、LIF及bFGF因子的添加以及不同種類的飼養(yǎng)層細(xì)胞對豬孤雌單倍體胚胎和體外受精胚胎類胚胎干細(xì)胞建系的影響。本研究共分四部分:一、比較不同的卵母細(xì)胞激活方法,確定能獲得高比率單倍體胚胎的孤雌激活方法；二、在實(shí)驗(yàn)一的基礎(chǔ)上,用能獲得高比率單倍體的激活方法生產(chǎn)孤雌胚胎,進(jìn)行豬單倍體孤雌胚胎類胚胎干細(xì)胞的

3、培養(yǎng)；三、通過常規(guī)體外受精方法生產(chǎn)豬IVF胚胎,進(jìn)行豬IVF胚胎類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)；四、比較孤雌胚胎和IVF胚胎的發(fā)育率和質(zhì)量,分析導(dǎo)致兩種胚胎具有不同貼壁和生長能力的可能因?yàn)?。結(jié)果如下:
　　 一、采用不同的物理或化學(xué)方法激活豬卵母細(xì)胞。試驗(yàn)一分別采用電激活、電激活結(jié)合細(xì)胞松弛素B(CB)、不同濃度乙醇以及不同作用時間對成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行激活處理,試驗(yàn)二檢測電激活結(jié)合MG-132或Thimerosal和DTT對成熟卵母細(xì)胞的激活

4、效果。試驗(yàn)一結(jié)果顯示電激活結(jié)合CB組(27.34％)處理后的囊胚率顯著高于電激活處理組(16.92％)(P<0.05),且二者均顯著高于所有的乙醇組(P<0.05),乙醇處理組中以9％乙醇作用11 min效果最佳(10.20％)。試驗(yàn)二結(jié)果顯示電激活結(jié)合MG-132組的囊胚發(fā)育率(24.69％)與電激活結(jié)合CB組(27.50％)沒有顯著差異,二者顯著高于電激活結(jié)合Thimerosal和DTT組(14.10％)及電激活處理組(17.5％)

5、(P<0.05)。對所得囊胚進(jìn)行染色體倍性分析后得出,電激活處理后的囊胚單倍體率(41.7％)與9％乙醇處理組(40％)和電激活結(jié)合Thimerosal和DTT處理組(35.3％)無顯著差異,但卻顯著高于電激活結(jié)合CB(0)及電激活結(jié)合MG-132(6.7％)處理組(P<0.05)。綜合囊胚發(fā)育率和囊胚單倍體比率,電激活、9％乙醇、電激活結(jié)合Thimerosal、DTT和電激活結(jié)合MG-132處理組獲得單倍體囊胚的總效率分別為7.3％(

6、17.5％×41.7％)、4.1％(10.2％×40％)、5.0％(14.1％×35.3％)和1.7％(24.69％×6.7％)。電脈沖處理可能是比較理想的獲得豬單倍體孤雌胚胎的激活方法。
　　 二、將發(fā)育到囊胚的豬孤雌胚胎去透明帶后,分別接入不同的培養(yǎng)液和不同的飼養(yǎng)層細(xì)胞中。將胚胎接入培養(yǎng)液Ⅰ(DMEM培養(yǎng)液:DMEM+bFGF+LIF+nucleoside mix+FBS)中,以MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞,胚胎貼壁率為0；將胚胎接

7、入培養(yǎng)液Ⅱ(BRL細(xì)胞條件化的TCM-199),在沒有飼養(yǎng)層細(xì)胞的情況下,胚胎貼壁率達(dá)到21.7％,但貼壁后的細(xì)胞有明顯的分化現(xiàn)象且未形成克隆。在培養(yǎng)液中添加LIF因子,胚胎貼壁率降至9.3％,沒有形成克隆。加上MEF飼養(yǎng)層后,胚胎無一貼壁；將胚胎接入培養(yǎng)液Ⅲ(小分子培養(yǎng)液:DMEM／F12+Neurobasal medium+N2827+PD0325901+CHIR99021)中,分別以MEF和L-cell為飼養(yǎng)層,胚胎均未貼壁,以M

8、EF和L-cell等比混合作為飼養(yǎng)層,獲得23.1％的貼壁率,貼壁后的細(xì)胞雖無分化卻未形成克?。慌咛ソ尤肱囵B(yǎng)液Ⅳ(DMEM／F12培養(yǎng)液:DMEM／F12+KSR+bFGF)中,以MEF作為飼養(yǎng)層,貼壁率為0；胚胎接入培養(yǎng)液Ⅴ(DMEM／HAM's-F10培養(yǎng)液:DMEM+HAM's-F10+NUTRIENT MIX+LIF+bFGF+KSR+FBS)中,以MEF作為飼養(yǎng)層,貼壁率為10％,但貼壁后的細(xì)胞也未形成克隆。
　　 三

9、、采用4種不同的培養(yǎng)液,即上述培養(yǎng)液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,以MEF、L-cell或STO細(xì)胞為飼養(yǎng)層,培養(yǎng)豬ⅣF囊胚。將胚胎接入培養(yǎng)液Ⅰ中,以MEF為飼養(yǎng)層,胚胎貼壁率為0；胚胎接入BRL條件化的培養(yǎng)液,在無飼養(yǎng)層細(xì)胞的情況下,其貼壁率達(dá)到37.5％,但貼壁后的細(xì)胞有明顯的分化現(xiàn)象且未形成克隆。胚胎接入培養(yǎng)液Ⅲ中,以MEF和L-cell等比混合作為飼養(yǎng)層,獲得27.8％的貼壁率,貼壁后的細(xì)胞未形成克??；將胚胎接入培養(yǎng)液Ⅳ中,以MEF為飼養(yǎng)層,

10、貼壁率為22％,貼壁后的胚胎能形成克隆的比率為63.6％,且有3個胚胎貼壁后己傳至第三代。以STO為飼養(yǎng)層,其貼壁率為25％,貼壁后的胚胎形成克隆率為75％,且有一個胚胎貼壁后傳至第一代。將于MEF及STO上貼壁生長的細(xì)胞用堿性磷酸酶鑒定均為陽性,將MEF上貼壁生長的細(xì)胞用Oct-4、SSEA-1免疫熒光染色,結(jié)果顯示為陽性,證實(shí)貼壁后生長的細(xì)胞為豬類胚胎干細(xì)胞。
　　 四、比較了孤雌胚胎及ⅣF胚胎的發(fā)育率、囊胚質(zhì)量和免疫熒光染