昆白小鼠胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、昆白小鼠是我國(guó)最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，但已經(jīng)建立的小鼠ES細(xì)胞系大多來源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠，而用昆白小鼠建系的報(bào)道很少。因此建立昆白小鼠細(xì)胞ES系對(duì)我國(guó)深入而便利地開展干細(xì)胞的研究具有重要意義。 本研究從昆白小鼠胚胎中分離克隆出小鼠ES細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行了傳代培養(yǎng)和鑒定，對(duì)影響小鼠ES細(xì)胞分離克隆的一些因素進(jìn)行了探討，目的在于篩選出更適合昆白小鼠ES細(xì)胞的分離克隆體系，為進(jìn)一步建立昆白小鼠ES細(xì)胞系奠

2、定基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下： 1.從446枚昆白小鼠胚胎中分離培養(yǎng)ES細(xì)胞，323枚ICM長(zhǎng)出，ICM形成率為72.4％；并從72枚ICM中得到ES細(xì)胞，ES細(xì)胞的形成率為16.1％，最高所傳代數(shù)為5代。 2.比較了不同的飼養(yǎng)層對(duì)昆白小鼠ES細(xì)胞分離克隆的影響：分別以MEF、STO、經(jīng)絲裂霉素C處理后冷凍再解凍的STO和PEF作為飼養(yǎng)層；在這4種飼養(yǎng)層上，胚胎的孵化率和ICM形成率差異不顯著；但在原代集落形成率和傳代次數(shù)上

3、差異顯著(p＜0.05)：MEF的效果最好，STO、經(jīng)絲裂霉素C處理后冷凍再解凍的STO次之，PEF最差。 3.利用BRL-CM作為培養(yǎng)液培養(yǎng)昆白小鼠的胚胎和ES細(xì)胞，胚胎可正常貼壁，ICM也可正常長(zhǎng)出；將ICM分離接種有飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層的條件中，只有條件培養(yǎng)基BRL-CM和飼養(yǎng)層相互結(jié)合時(shí)，才能促進(jìn)昆白小鼠的ES細(xì)胞增殖并維持早期傳代而保持不分化狀態(tài)，這說明昆白小鼠ES細(xì)胞分離培養(yǎng)過程中，BRL-CM還不能完全替代飼養(yǎng)層的作用

4、。 4.比較了不同的傳代方法對(duì)昆白小鼠ES細(xì)胞分離克隆的影響：分別用0.25％的Trypsin-EDTA和2.4U/mL的Diapase作為消化液以酶消化法，用0.10％的Trypsin-EDTA和2.4U/mL的Diapase作為消化液以酶消化法+機(jī)械剝離來傳代ES細(xì)胞；0.25％的Trypsin-EDTA對(duì)細(xì)胞的損傷較大，不適合昆白ES細(xì)胞的傳代，其他3種方法均適合昆白ES細(xì)胞的傳代。 5.對(duì)分離得到的ES細(xì)胞進(jìn)行了