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1、目的：到目前已經(jīng)建立數(shù)百個小鼠胚胎干細胞系，昆明小鼠是我國應(yīng)用最多的實驗小鼠，其建系成功報道極少。小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養(yǎng)層是胚胎干細胞培養(yǎng)最常用的方法，但其制備過程繁瑣，工作量大，準備周期長，探索一簡單小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層制備方法，建立一有效的昆明小鼠胚胎干細胞分離培養(yǎng)體系，以提高昆明鼠胚胎干細胞建系成功率。
方法：昆明小鼠經(jīng)孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（HCG）促排卵，取11.5-16.5d
2、 胎齡的胎鼠用兩種簡化方法分離培養(yǎng)原代成纖維細胞，倒置顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)方法培養(yǎng)的原代和繼代鼠胚成纖維細胞（MEF）的生長形態(tài)、結(jié)構(gòu)及細胞數(shù)量的變化；收集MEF進行凍存保存；MEF 經(jīng)不同濃度作用時間的絲裂霉素C 處理制備飼養(yǎng)層。昆明鼠交配后3.5-4.5天取胚胎，將胚胎種在添加血清替代物（Knockout serum replacement，KSR）或添加胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）培養(yǎng)液的上述飼養(yǎng)層中培
3、養(yǎng)，觀察胚胎貼壁、內(nèi)細胞團（Inner cell mass，ICM）集落形成率，4-6天后對增殖的內(nèi)細胞團團塊，在0.05%trypsin-0.02EDTA 消化液中用切割法處理后，再接種到新的飼養(yǎng)層上。對傳數(shù)代后的細胞集落進行干細胞標記物的鑒定。
結(jié)果：兩種簡化方法均能培養(yǎng)出高效優(yōu)質(zhì)足量的原代MEF；以兩種濃度和作用時間的絲裂霉素C 處理，操作方便并獲得細胞生長狀態(tài)良好的飼養(yǎng)層。妊娠3.5天孕鼠適宜胚胎干細胞的分離培養(yǎng)，
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