4830.酵母ars缺失突變體的構(gòu)建及組蛋白h3h4定點突變菌株功能的檢測

1、碩士學位論文碩士學位論文論文題目：論文題目：酵母ARS缺失突變體的構(gòu)建及組蛋白H3H4定點突變菌株功能的檢測英文題目：英文題目：ConstructionofAutonomouslyReplicatingSequenceDeletionStrainsFunctionDetectionofPointMutationsofH3H4HistonesinS.cerevisiae學位類別學位類別：理學碩士研究生姓研究生姓名：薛濤濤學號學號：2013

2、023065學科學科(領域領域)名稱名稱：生物學（微生物學）指導教指導教師：趙秀娟職稱職稱：教授協(xié)助指導教師：協(xié)助指導教師：職稱：職稱：2016年6月20日分類號：分類號：Q9393密級：級：公開公開UDC：學校代碼：學校代碼：1012710127內(nèi)蒙古科技大學碩士學位論文I摘要真核生物DNA復制起始的準確調(diào)控是DNA復制的重要保障，其中，復制起始位點的選擇與組蛋白的表觀遺傳修飾是調(diào)控DNA復制起始的重要方式。DNA復制的起始主要受酵母

3、自主復制序列ARS與復制起始蛋白的調(diào)控，組蛋白H3H4上所發(fā)生的乙酰化、甲基化等修飾也參與了DNA的復制與損傷修復等過程。本文工作包括構(gòu)建釀酒酵母III號染色體ARS缺失突變體、構(gòu)建釀酒酵母組蛋白H3H4定點突變體、RealtimePCR法檢測組蛋白H4K5乙?；瘜椭破鹗枷嚓P蛋白表達的影響及組蛋白定點突變體的功能驗證，對研究釀酒酵母DNA復制起始調(diào)控的機制具有重要的生物學意義。具體內(nèi)容如下：1.以釀酒酵母BY4741為實驗材料，依據(jù)酵

4、母同源重組原理構(gòu)建高活性ARS306缺失突變株。以質(zhì)粒pRS416為模板，經(jīng)PCR擴增得到URA3基因，采用PCR介導酵母轉(zhuǎn)化的方法來敲除高活性的ARS306。為了消除外源標記基因序列對復制起始的影響，以質(zhì)粒HcKanP為載體，構(gòu)建了含高活性ARS左右同源臂相連接的序列的重組子質(zhì)粒，為后續(xù)ARS突變株的構(gòu)建提供了基礎。2.采用兩步替換法構(gòu)建酵母組蛋白H3H4定點突變菌株。第一步用NAT基因置換掉II號染色體組蛋白H3H4基因HHT1HH

5、F1，從而構(gòu)建了以諾爾斯菌素抗性基因為標記基因的釀酒酵母HHT1HHF1敲除菌株，第二步通過對組蛋白H3H4定點突變質(zhì)粒進行了酶切得到H3定點突變基因hhtSHHFS及H4定點突變基因HHTShhfS，依據(jù)同源重組的原理替換掉了XIV號染色體組蛋白H3H4基因HHT2HHF2，得到組蛋白H3H4定點突變體，為后續(xù)研究組蛋白修飾的生物學功能提供了基礎。3.利用RealtimePCR技術來檢測釀酒酵母組蛋白H4K5位點去乙?；瘜椭破鹗枷嚓P

6、蛋白基因表達的影響，從而進一步探討組蛋白H4第5位賴氨酸(K)修飾對酵母DNA復制的重要性。相對定量結(jié)果顯示，組蛋白H4第5位賴氨酸在去乙?；癄顟B(tài)下，基因PSF3的表達與野生型相比無明顯變化，表明組蛋白H4第5位賴氨酸的乙酰化修飾對復制起始過程中PSF3基因的表達不具有影響，而基因CDT1的表達上調(diào)了約7.5~8.0倍，基因CDC6上調(diào)了約2.0~2.5倍，CDC7基因上調(diào)了約2.5~3.0倍，表明組蛋白H4第5位賴氨酸的去乙酰化調(diào)控了