16024.堿蓬親環(huán)素基因sscyp1cdna的克隆、原核表達(dá)和耐鹽性相關(guān)分析

1、I摘要土壤鹽漬化嚴(yán)重影響世界農(nóng)業(yè)發(fā)展，成為危及人類(lèi)生存的重大資源環(huán)境問(wèn)題。為尋求開(kāi)發(fā)鹽漬地資源、提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量，一般采用生化分子技術(shù)方法從耐鹽植物中克隆耐鹽基因并在其他高產(chǎn)的非耐鹽植物中表達(dá)，使非耐鹽植物能在鹽脅迫環(huán)境下高產(chǎn)。親環(huán)素(Cyclophilins，CyPs)是一類(lèi)廣泛存在于各生命體的多基因家族，一般分布在細(xì)胞質(zhì)與各種細(xì)胞器中，具有肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PPIase)活性，能夠誘導(dǎo)脯氨酸肽鍵的順?lè)串悩?gòu)化，使蛋白質(zhì)正確折疊。研究表明

2、，植物體內(nèi)親環(huán)素的酶活性與植物的抗逆性密切相關(guān)，過(guò)量表達(dá)的親環(huán)素基因能夠明顯的提高植物對(duì)高鹽脅迫的抵抗力。鹽地堿蓬(Suaedasalsa)是一種典型的鹽堿地指示植物。本論文以鹽地堿蓬為材料，克隆一個(gè)親環(huán)素基因SsCYP1，通過(guò)序列分析并在大腸桿菌中成功表達(dá)，最后在不同的鹽濃度的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行耐鹽性分析。研究結(jié)果如下：1、鹽地堿蓬親環(huán)素基因SsCYP1的克隆以及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析通過(guò)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增和RACE技術(shù)，克隆出堿蓬基因全長(zhǎng)，大小為

3、875bp，編碼區(qū)為531bp，編碼176個(gè)氨基酸，分子量約為18.8KDa，等電點(diǎn)為7.67，富含Gly和Lys，其W、V)，39個(gè)親水性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。該基因編碼的蛋白與金絲小棗（Ziziphusjujuba），薺菜（Capsellarubella）等氨基酸序列同源性達(dá)到88%，二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋（19.89%）、隨機(jī)卷曲（40.34%）、延伸鏈（28.41%）和少量的β轉(zhuǎn)角（11.36%）構(gòu)成；信號(hào)肽分析顯示SsC

4、YP基因所編碼的蛋白無(wú)信號(hào)肽；跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示該蛋白不具備跨膜結(jié)構(gòu)；疏水性分析顯示該蛋白兩端是親水性的；螺旋卷曲分析顯示該蛋白形成卷曲的可能性很低；磷酸化位點(diǎn)分析顯示該蛋白有7個(gè)磷酸化位點(diǎn)。2、SsCYP1基因異源性表達(dá)根據(jù)獲得的全長(zhǎng)序列在編碼區(qū)兩端設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端引入BamHI和NotI雙酶切位點(diǎn)。構(gòu)建原核表達(dá)載體pETdute1SsCYP1后轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)SDSPAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的蛋白