小麥籽粒多酚氧化酶（PPO）活性功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究.pdf

1、多酚氧化酶(PPO)是導(dǎo)致面條、饅頭、餃子等面制食品發(fā)生褐變的主要因素,降低小麥籽粒中的PPO活性可以有效改善面制食品的外觀品質(zhì)。由于目前主要采用生化的方法測(cè)定小麥籽粒中的PPO活性,存在成本高、易受環(huán)境影響、不能在育種早代材料中檢測(cè)、選擇效率低等問(wèn)題,因此研究小麥PPO基因遺傳變異的規(guī)律,開(kāi)發(fā)出小麥籽粒PPO活性功能標(biāo)記,對(duì)于低籽粒PPO活性分子育種和我國(guó)面制食品外觀品質(zhì)的改良有重要意義。本研究對(duì)NCBI上最新公布的小麥PPO基因序列

2、進(jìn)行了搜索和比對(duì)并根據(jù)在小麥籽粒中表達(dá)的PPO基因序列設(shè)計(jì)引物,對(duì)這些引物的功能進(jìn)行驗(yàn)證,開(kāi)發(fā)小麥籽粒PPO活性功能標(biāo)記。同時(shí)研究中國(guó)小麥種質(zhì)資源的籽粒PPO活性遺傳變異和基因型的分布規(guī)律以及PPO基因的等位變異對(duì)籽粒PPO活性的影響,獲得了如下主要結(jié)果： 1.根據(jù)NCBI網(wǎng)站上新注冊(cè)的3條小麥PPO基因(GenBank:AY515506、AY596270和AF507945)序列,在不同位置設(shè)計(jì)了多對(duì)引物,對(duì)7個(gè)高PPO活性和7

3、個(gè)低PPO活性小麥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一對(duì)引物(STS01)在高、低PPO活性材料中表現(xiàn)出多態(tài)性。該引物在7個(gè)低PPO活性的材料中能擴(kuò)增出560 bp的目標(biāo)片段,在7個(gè)高PPO活性的材料中沒(méi)有擴(kuò)增出目標(biāo)片段,利用中國(guó)春缺體、四體及雙端體將該標(biāo)記定位在2D染色體長(zhǎng)臂上。利用該標(biāo)記檢測(cè)130份小麥品種,結(jié)果表明有75個(gè)品種可以擴(kuò)增出560 bp的目標(biāo)片段,其PPO活性均值為221.08;55個(gè)品種沒(méi)有擴(kuò)增出目標(biāo)片段,PPO活性均

4、值為309.98,方差分析表明兩者的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。利用STS01和PPO18(小麥2A染色體上PPO基因STS分子標(biāo)記)共同檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),在130份小麥品種中有37個(gè)品種的雙標(biāo)記擴(kuò)增均表現(xiàn)出高活性帶型(H1H2),這些品種PPO活性的均值為337.82,顯著高于其他幾種擴(kuò)增帶型品種的PPO活性均值(P<0.01)。32個(gè)雙標(biāo)記擴(kuò)增均表現(xiàn)為低活性帶型(L1L2)的小麥品種PPO活性值普遍較低,可作為改良面制食品外觀品質(zhì)的

5、候選親本。因此STS01是一個(gè)位于小麥2D染色體長(zhǎng)臂上PPO基因分子標(biāo)記,可以在小麥PPO活性分子標(biāo)記輔助選擇中加以應(yīng)用。 2.通過(guò)對(duì)NCBI上注冊(cè)的小麥PPO基因序列的搜索與比對(duì)后發(fā)現(xiàn),現(xiàn)有的小麥PPO基因按表達(dá)方式可分為兩大類(Ⅰ、Ⅱ),其中第Ⅱ大類的PPO基因與小麥籽粒PPO活性密切相關(guān),第Ⅱ大類第i小類中的PPO基因可能位于小麥2A、2D以外的染色體上,可做為改良面團(tuán)色澤的侯選基因。通過(guò)對(duì)具有完整開(kāi)放閱讀框(ORF)的4

6、條PPO基因比對(duì)后發(fā)現(xiàn),位于小麥2D染色體長(zhǎng)臂上的PPO基因(PPO-2D)存在豐富的等位變異,等位基因間有94個(gè)單核苷酸變異(SNP),其中發(fā)生在編碼區(qū)的有80個(gè)(cSNP),這些cSNP中有36個(gè)影響到基因編碼的氨基酸序列,屬非同義cSNP。在非同義cSNP處,設(shè)計(jì)引物(STS-H),對(duì)130個(gè)已連續(xù)測(cè)得兩年P(guān)PO活性的小麥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)STS-H在大部分低PPO活性品種中沒(méi)有擴(kuò)增出目標(biāo)片段(a),而大部分高PPO活性

7、品種可以擴(kuò)增出460bp的目標(biāo)片段(b)。方差分析表明,a、b兩種類型品種的PPO活性均值差異達(dá)極顯著水平(p<0.01),說(shuō)明非同義cSNP對(duì)小麥籽粒PPO活性有重要影響。與STS01比較后發(fā)現(xiàn),STS-H與STS01是一對(duì)互補(bǔ)標(biāo)記,根據(jù)STS01和STS-H引物各自的特點(diǎn),研究了能同時(shí)擴(kuò)增兩對(duì)引物的多重PCR反應(yīng)體系。 3.以251份基因多樣性豐富的中國(guó)小麥微核心種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料,2004-2005年度種植于兩個(gè)地點(diǎn)(安徽

8、合肥、鳳陽(yáng)),采用生化和特異引物PCR擴(kuò)增的方法對(duì)其PPO活性及基因型進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：中國(guó)小麥微核心種質(zhì)資源品種間PPO活性差異明顯,并且低PPO活性的品種居多；基因型、地點(diǎn)及其互作對(duì)PPO活性的影響達(dá)到1％顯著水平。利用控制小麥PPO活性兩個(gè)主效基因位點(diǎn)的特異PCR引物擴(kuò)增結(jié)果表明,中國(guó)小麥微核心種植資源中共檢測(cè)出PPO-2Aa1/PPO-2Da2(a1a2)、PPO-2Aa1/PPO-2Db2(a1b2)、PPO-2Ab1/P

9、PO-2Da2(b1a2)和PPO-2Ab1/PPO-2Db2(b1b2)四種標(biāo)記基因型,標(biāo)記基因型間PPO活性均值的大小順序?yàn)?a1a2

10、Db2的4倍,單倍型效應(yīng)分析表明相同染色體上單倍型間的PPO活性關(guān)系為:PPO-2Aa1

11、著(P<0.01)低于來(lái)源于3個(gè)春麥區(qū)小麥品種的PPO活性均值；地方小麥品種的PPO活性均值最低,顯著(P<0.01)低于育成品種和國(guó)外引進(jìn)品種的PPO活性均值,說(shuō)明小麥PPO活性在地區(qū)分布上存在一定的規(guī)律性,小麥品種的PPO活性與品種來(lái)源和人工選擇有關(guān)。 4.為了克隆出小麥不同染色體上控制籽粒PPO活性的PPO基因,利用小麥2A和2D染色體上PPO基因一致性高的特點(diǎn),在兩個(gè)基因(PPO-2A和PPO-2D)相同序列處設(shè)計(jì)了一對(duì)

12、引物(PPO05),對(duì)高、低活性不同的小麥品種進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5％瓊脂糖凝膠上PPO05在低PPO活性小麥品種中可以擴(kuò)增出兩條帶(a：位于DNA Marker1000-750bp之間和b：750-500bp之間),而在高PPO活性小麥品種中只擴(kuò)增出一條位于750-500bp之間的條帶(b)。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果發(fā)現(xiàn)b條帶實(shí)際包含2-3條長(zhǎng)度相近的DNA片段。對(duì)這些條帶進(jìn)行分離、純化和測(cè)序,并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST