小麥籽粒脂肪氧化酶活性功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用.pdf

1、脂肪氧化酶(LOX)是影響小麥籽粒和面粉儲(chǔ)藏特性的主要因素之一,通過(guò)降低小麥籽粒中的LOX活性可以有效地延長(zhǎng)其儲(chǔ)藏時(shí)間。目前主要采用生化檢測(cè)的方法來(lái)測(cè)定小麥籽粒中的LOX活性,但此方法成本較高,完成一次檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)且選擇效率低,不能檢測(cè)育種早代材料中的LOX活性,因此本文試圖通過(guò)研究小麥LOX基因遺傳變異的規(guī)律,開發(fā)出小麥籽粒LOX活性的分子標(biāo)記,來(lái)改良LOX活性。本試驗(yàn)對(duì)已公布的LOX基因序列進(jìn)行了搜索和比對(duì)并設(shè)計(jì)引物,研究小麥籽粒

2、LOX活性的功能標(biāo)記,并用該標(biāo)記分析了203份小麥品種(系)基因型與表型之間的關(guān)系。主要結(jié)果如下:
　　1、根據(jù)NCBI網(wǎng)站上已公布的小麥LOX基因(GenBankGU167920.1)序列,在不同位置設(shè)計(jì)了多對(duì)引物,以LOX活性差異較大的兩組材料基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一對(duì)引物(LOX1-wp01)在高、低LOX活性材料中表現(xiàn)出多態(tài)性。引物L(fēng)OX1-wp01擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶型在兩組材料間存在明顯差異,其在高

3、LOX活性的材料中均擴(kuò)增出a、b、c三條帶,在低LOX活性的材料中均擴(kuò)增出a、c兩條帶。利用該標(biāo)記檢測(cè)203份小麥品種,結(jié)果表明有164個(gè)品種可以擴(kuò)增出a、b、c三條帶,占總樣本量的80.79％,其LOX活性平均值為10.46nkat/g;39個(gè)品種擴(kuò)增出a、c兩條帶,占總樣本量的19.21%,LOX活性平均值為7.36nkat/g,方差分析表明兩者的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。因此,認(rèn)為L(zhǎng)OX1-wp01可以在小麥LOX活性分子

4、標(biāo)記輔助選擇中加以應(yīng)用。
　　2、利用LOX1-wp01對(duì)203份小麥品種(系)的基因型進(jìn)行檢測(cè),分別篩選到鶴麥026、內(nèi)白、W1032、鄭麥9405、魯麥22、安農(nóng)糯1、ZWY-10、周麥16、皖協(xié)497、煙農(nóng)21等10份高LOX活性品種(系),LOX活性在14.65nkat·g-1~19.43nkat·g-1之間;周麥11、蒿優(yōu)9409、淮麥19、內(nèi)鄉(xiāng)188、P206、陜228、揚(yáng)輻麥5242、皖0606、安農(nóng)95081-8、

5、皖0202等10份低LOX活性品種(系),LOX活性在4.56nkat·g-1~5.93nkat·g-1之間。這些資源材料對(duì)于針對(duì)小麥LOX活性的品質(zhì)改良研究具有一定的實(shí)際意義。
　　3、切取電泳條帶a、b、c回收、測(cè)序,經(jīng)Blast分析發(fā)現(xiàn),a、b、c三條序列都與小麥LOX1基因存在高度同源性,a序列與硬粒小麥Lpx-B1.2(HM126467.1)基因序列重合區(qū)域?yàn)?9%,相似率達(dá)100%;b序列與硬粒小麥Lpx-B1.1(H

6、M126468.1)基因序列重合區(qū)域?yàn)?00%,相似率達(dá)99%;c序列與硬粒小麥Lpx-B1.1(HM126468.1)基因序列重合區(qū)域?yàn)?9%,相似率達(dá)96%。同時(shí),a、b、c三條序列自身也存在高度同源。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在所擴(kuò)增的基因序列片段中存在3個(gè)內(nèi)含子,所有內(nèi)含子都符合內(nèi)含子的GT-AG法則,且3條序列的差異區(qū)段都分布在這3個(gè)內(nèi)含子之間。因此,本研究認(rèn)為在普通六倍體小麥中LOX1存在3個(gè)位點(diǎn),分別指定序列a為L(zhǎng)OX1.2(Gen

7、BankJQ715610),序列b為L(zhǎng)OX1.1(GenBankJQ715609),序列c為L(zhǎng)OX1.3(GenBankJQ715611)。
　　4、通過(guò)對(duì)NCBI上注冊(cè)的禾本科作物L(fēng)OX基因序列的搜索與比對(duì)后發(fā)現(xiàn),禾本科作物的LOX基因大體聚為四類,第一類包括L37359.1、HQ913602.1和DQ474244.1,都為L(zhǎng)OX3基因;第二類包括NM001112503.1、X64396.1、L37358等7條LOX2基因;第三

8、類包括HM126467.1、DQ474241.1、JQ715610等14條LOX1基因;第四類包括EU725461.1和AB099850.1兩條LOX1基因。從分類上看,LOX1基因被分為了兩類,即第三類和第四類,水稻屬的兩條LOX1基因(EU725461.1和AB099850.1)單獨(dú)被分為了一類,表明水稻屬LOX1基因的親緣關(guān)系與其他禾本科作物L(fēng)OX1基因的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。另外,對(duì)上述前三類進(jìn)一步分析,認(rèn)為小麥屬LOX基因與大麥屬LO

9、X基因的親緣關(guān)系最近。
　　5、根據(jù)同源性設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR技術(shù),克隆到六倍體普通小麥LOX1基因cDNA片段,大小為384bp,推導(dǎo)氨基酸殘基為127個(gè),分子量為11.15kD,等電點(diǎn)pI為4.93,與杜倫小麥、大麥、高粱、水稻的相似率分別為99.7%、94.8%、73.7%、56.2%,結(jié)果表明親緣關(guān)系相近的物種之間核苷酸序列差異小且遺傳距離也小,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種之間核苷酸序列差異較大,遺傳距離較遠(yuǎn)。可見,物種之間的