11460.新型低溫蛋白酶基因的克隆表達及酶學性質研究

1、分類號：Q815密級：(秘密、機密、絕密)學校代碼：10057研究生學號：11812508新型低溫蛋白酶基因的克隆表達及酶學性質研究Genecloning，expressionandcharacterizationofnovelcoldadaptedproteases專業(yè)名稱：指導教師姓名：研究生姓名：申請學位級別：論文提交日期：論文課題來源：學位授予單位：微生物與生化藥學(理)路福平教授莫清珊理學碩士2014年5月自選天津科技大學摘要

2、低溫蛋白酶是指最適催化溫度在40℃以下的一類蛋白水解酶，一般由嗜低溫微生物或耐低溫微生物產(chǎn)生。由于其最適催化溫度接近自然環(huán)境中的溫度，因此在應用過程中可省去加熱和冷卻過程，與中高溫蛋白酶相比具有節(jié)能、省時等特點。本研究旨在從嗜低溫微生物中篩選新型低溫蛋白酶，研究分析其酶學性質，并對編碼基因進行克隆與表達方面的研究。具體研究工作包括如下4個方面：(1)從南印度洋的深海沉積物中分離到一株嗜低溫動性球菌(Planococcussp11815)

3、，該菌株可以在04℃之間進行正常的生長代謝，并在20℃以下具有表達分泌低溫蛋白酶的能力，經(jīng)48h搖瓶發(fā)酵，蛋白酶產(chǎn)量可達280U／mL。酶學性質分析結果顯示：該菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH值為80，最適作用溫度為37℃，當催化溫度降至30℃時，酶活可保持在80％以上，并且在4℃條件下仍具有水解蛋白的能力。因此該菌株所產(chǎn)蛋白酶屬于典型的低溫堿性蛋白酶，具有一定的研究及開發(fā)價值。(2)通過設計簡并性引物并采用反向PCR的方式從篩選獲得的嗜低

4、溫動性球菌中分別克隆到兩種蛋白酶編碼基因：cpls8和cpls41，序列分析結果顯示：cpls8所編碼的蛋白屬于絲氨酸蛋白酶中的S8家族，是一種胞內蛋白酶；而cpls41所編碼蛋白屬于$41家族，是一種分泌型蛋白酶。Blast比對結果顯示：cpls8與cpls41基因所編碼蛋白與目前數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的蛋白酶序列的最高同源性分別為72％和76％，因此可確定為新型編碼基因。(3)將cpls8基因克隆至表達型載體pET22b上，并在大腸桿菌Ro

5、sseta(DE3)中實現(xiàn)了功能表達。重組蛋白酶CPLS8經(jīng)分離純化后，比酶活可達到3268U／mg，其最適作用溫度為37℃，最適pH為100，在45℃保溫60min，則酶活完全喪失。Ca對該酶起促進作用，而EDTA等離子鰲合劑以及PMSF則對該酶有抑制作用。(4)將cpls41的編碼基因分別克隆至融合表達載體pET32a上，在EcoliRossetaDE3中實現(xiàn)了CPLS41的融合表達。經(jīng)蛋白分離純化、腸激酶處理去除融合蛋白后，CPL