膠原蛋白酶的純化及其基因的克隆與表達研究.pdf

1、膠原蛋白酶(collagenolytic protease)是指能降解天然非變性膠原的一類酶.在醫(yī)學研究中可用于治療椎間盤突出癥等,實驗室研究中作為工具酶應用于細胞和器官的分離,基礎研究中可應用于膠原結構的研究,工業(yè)開發(fā)中可應用于膠原分級降解以獲得膠原多肽,具有重要的理論研究意義和應用研究價值.微生物和動物組織來源的膠原蛋白酶已經有廣泛的研究,至少從不同細菌和真菌中獲得40余種膠原蛋白酶,但由于它們大多來源于致病菌株,目前能夠商業(yè)化生產

2、的膠原蛋白酶的菌株很少.本實驗從成都皮革廠等經常堆積廢棄毛皮、皮革的場所采集土樣,通過富集、初篩、牛皮消化試驗和膠原蛋白酶活性測定等方法,獲得12株具有膠原蛋白酶活性的菌株.通過形態(tài)觀察、生理生化特征分析及BIOLOG微生物鑒定儀鑒定,分別鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudumonas aeraginosa)和火神發(fā)光桿菌(Photobacterium logei).根據膠原蛋白酶PAC-SubA亞基N末端測序結果和同源性分析,設計了PCR

3、引物擴增出并克隆到SubA亞基的全基因.測序結果顯示,該片段全長2011bp,編碼區(qū)全長1494bp,該片段是一個完整的基因,命名為pacA基因.該基因編碼的蛋白質序列包含有23個氨基酸殘基組成的信號肽和174個殘基組成的前肽序列.同源性分析表明,該基因序列與已經報道的銅綠假單胞菌PA01菌株彈性蛋白酶lasB基因序列同源性99％,推導成熟肽氨基酸序列完全相同.將含有pacA全基因的重組質粒轉化大腸桿菌Escherichia coli