18646.d對羥基苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因表達與活性研究

1、D對羥基苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因表達與活性研究對羥基苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因表達與活性研究OptimizedExpressionoftheRecombinanthpgtGeneEnzymeKiicacteristics學(xué)科專業(yè)：制藥工程研究生：王宗瑞指導(dǎo)教師：趙廣榮教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一二年五月摘要苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（4Hydroxyphenylglycineaminotransferase）是假單胞菌所產(chǎn)生的一種能夠合成D苯甘氨酸的重

2、要轉(zhuǎn)氨酶。目前國內(nèi)對于該酶的研究較少，因此對于該重組酶體外活性的測定，研究其主要功能和酶動力學(xué)，對于該酶在工業(yè)上的應(yīng)用有重要的意義。依據(jù)密碼子偏好性，設(shè)計、優(yōu)化、合成hpgt全長基因，并成功構(gòu)建了大腸桿菌畢赤酵母穿梭載體pPIC9Khpgt，并將其整合至畢赤酵母GS115的染色體中，以期實現(xiàn)其分泌表達。對整合有hpgt基因的畢赤酵母進行搖瓶發(fā)酵實驗，獲得了重組酶，并測定轉(zhuǎn)化率及其酶的活性。構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pCDFhpgt，并將其轉(zhuǎn)入感受

3、態(tài)細胞E.coliBL21（DE3），通過優(yōu)化表達條件獲得可溶性的重組蛋白HisHpgT。利用NiNTA柱純化技術(shù)獲得高純度的HisHpgT融合蛋白，蛋白濃度為0.405mgmL。分別測定融合蛋白在正反向反應(yīng)中的酶活力單位及最佳的反應(yīng)溫度、pH值及其他動力學(xué)參數(shù)，并對該酶特性作相關(guān)的機理分析。測定結(jié)果表明，正向反應(yīng)和反向反應(yīng)的酶比活力分別為749mUmg、2257mUmg，此酶分解苯甘氨酸的能力要強于合成苯甘氨酸；正向反應(yīng)的最適溫度與p