血清microRNA對(duì)持續(xù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常慢性乙肝病毒感染者的診斷價(jià)值.pdf

1、我國(guó)肝臟疾病中慢性乙肝病毒（HBV）仍是主要病因，由于仍然缺乏根治乙肝病毒藥物，目前慢性乙型肝炎治療的總體目標(biāo)只能是最大限度地長(zhǎng)期抑制 HBV，減輕肝細(xì)胞炎癥壞死及肝纖維化，延緩和減少肝臟失代償、肝硬化、HCC及其并發(fā)癥的發(fā)生，從而改善生活質(zhì)量和延長(zhǎng)存活時(shí)間。對(duì)慢性乙肝治療適應(yīng)癥的判斷需依賴HBV病毒學(xué)指標(biāo)，生化學(xué)指標(biāo)甚至肝組織學(xué)檢查。
　　丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)被世界衛(wèi)生組織

2、推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)，也是各種指南關(guān)于慢性乙肝抗病毒治療和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。但近年來(lái)，不斷有持續(xù)ALT正常（persistently normal ALT,PNALT）慢性乙肝病毒感染者伴有明顯肝損傷的報(bào)道.甚至發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌的報(bào)道。對(duì)這類慢性乙肝的特殊群體，由于報(bào)道的人群不同，樣本量相差大，掌握ALT正常的持續(xù)時(shí)間不同等原因，結(jié)果不一：有的報(bào)道認(rèn)為PNALT人群，肝組織損傷輕2％-3%；有的報(bào)道中度以上的肝纖維化

3、比率達(dá)49%(42/85)。對(duì)PNALT這個(gè)特殊人群，各種慢性乙肝防治指南均建議嚴(yán)密觀察和肝穿刺組織學(xué)檢查，但肝穿刺的有創(chuàng)性，標(biāo)本的局限性以及病理醫(yī)生的主觀差異性等問(wèn)題，決定了肝穿刺難以被患者普遍接受，發(fā)展新的無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)以及尋找新的生物診斷標(biāo)志物一直是研究的熱點(diǎn)。
　　我們自2006年來(lái)長(zhǎng)期關(guān)注PNALT慢性乙肝病毒感染者這一群體，積累的病例及生物標(biāo)本在2000例以上。本研究采用回顧前瞻性研究，試圖闡述以下問(wèn)題：
　　一、

4、PNALT慢性乙肝感染者的臨床特點(diǎn)和病理特點(diǎn)，其影響因素？
　　二、除了病理診斷目前常用的無(wú)創(chuàng)性肝纖維化指標(biāo)（技術(shù)）對(duì) PNALT慢性乙肝的診斷效應(yīng)如何？
　　三、血清miRNA具有生物標(biāo)志物特性，在顯著肝組織損傷的PNALT與不顯著肝組織損傷PNALT之間是否存在差異表達(dá)的miRNA?
　　四、如果存在差異的miRNA表達(dá)，可否進(jìn)一步篩選出用于診斷的miRNA組合？
　　第一部分持續(xù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常的慢性乙

5、型肝炎病毒感染者的臨床、肝臟病理學(xué)特點(diǎn)及相關(guān)因素分析
　　目的:了解持續(xù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常（PNALT）的慢性乙肝感染者的臨床及肝臟病理學(xué)特點(diǎn)。
　　方法:采用回顧-前瞻性連續(xù)觀察我院2006年8月至2013年12月的所有進(jìn)行過(guò)肝穿刺病理學(xué)檢查的慢性乙肝感染者，共入選2467例進(jìn)行過(guò)肝穿刺慢性乙肝病例，排除1210例。PNALT共589例，其中HBeAg陽(yáng)性228例，HBeAg陰性，361例；持續(xù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶間斷正常（

6、PIALT1）(ALT1-2ULN,n=386)，其中HBeAg陽(yáng)性187例，HBeAg陰性，199例；PIALT2(ALT>2ULN,n=282)，其中HBeAg陽(yáng)性156例，HBeAg陰性，126例。肝組織標(biāo)本行蘇木精--伊紅染色、纖維Masson染色等染色，進(jìn)行Knodell壞死炎癥評(píng)分和Ishak纖維化評(píng)分。Logistic回歸分析相關(guān)危險(xiǎn)因素，受試者工作曲線下面積（the area of receiver operating

7、characteristic(ROC) curve,AUC）評(píng)價(jià)相應(yīng)因素的診斷價(jià)值。
　　結(jié)果: HBeAg陽(yáng)性 PNALT,PIALT1和 PIALT2中度以上炎癥壞死比率分別為16.23%（37/228）,26.74%(50/187)和30.13%（47/156）;中度以上肝纖維化比率分別為14.47%（33/228）,22.46%(42/187)和23.72%（37/156）; HBeAg陰性PNALT,PIALT1和PIA

8、LT2中度以上炎癥壞死比率分別為13.30%（48/361）,22.11%(44/199)和24.60%（31/126）;中度以上肝纖維化比率分別為16.62%（60/361）,23.62%(47/199)和25.40%（32/126）。將ALT正常與否視為二分類變量，Logistic回歸分析HBeAg陽(yáng)性慢性乙肝感染者發(fā)現(xiàn)HBV DNA高載量，AST以及年齡40~60歲是ALT異常的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；Logistic回歸分析HBeAg陰性

9、慢性乙肝感染者發(fā)現(xiàn)AST以及年齡40~60歲是ALT異常的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。將顯著性炎癥壞死和顯著性肝纖維化分別與非顯著性病理?yè)p傷視為二分類變量，Logistic回歸分析HBeAg陽(yáng)性PNALT發(fā)現(xiàn)無(wú)相關(guān)獨(dú)立危險(xiǎn)因素與顯著性肝病理?yè)p傷有關(guān)；同樣方法發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性PNALT發(fā)現(xiàn)年齡40~60歲是顯著性肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。使用ROC觀察AUC發(fā)現(xiàn)ALT在對(duì)PIALT與PNALT的診斷價(jià)值上，對(duì)顯著性炎癥壞死有一定的診斷價(jià)值而無(wú)論E抗原狀

10、態(tài)，但只對(duì)E抗原陰性慢性乙肝肝纖維化有一定診斷價(jià)值。但如單一針對(duì)PNALT患者在肝組織病理?yè)p傷上無(wú)診斷價(jià)值。
　　結(jié)論:大樣本連續(xù)性觀察了PNALT和 PIALT慢性乙肝感染者的臨床和肝組織病理學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)ALT在對(duì)PIALT與PNALT的診斷價(jià)值上仍一定程度反映了肝組織學(xué)的損傷程度，但對(duì)PNALT人群無(wú)肝組織學(xué)的損傷診斷價(jià)值。
　　第二部分無(wú)創(chuàng)肝纖維化診斷技術(shù)在PNALT慢性乙肝感染者中的應(yīng)用
　　目的:ALT難以區(qū)

11、別PNALT慢性乙肝感染者，了解無(wú)創(chuàng)肝纖維化診斷技術(shù)在PNALT慢性乙肝感染者中的診斷效應(yīng)
　　方法:研究采用回顧前瞻性研究，病例來(lái)自于我院2013年8月至2014年10月所有的慢性乙肝感染者進(jìn)行肝穿刺病理檢查并進(jìn)行過(guò) FibroScan檢測(cè)的患者，病例包含第一部分中部分和新入組病人，共入選245例，PNALT共95例，其中HBeAg陽(yáng)性45例，HBeAg陰性，50例；PIALT(ALT1-2ULN,n=86)，其中HBeAg陽(yáng)性

12、36例，HBeAg陰性，50例；PIALT(ALT≥2ULN,n=64)，其中HBeAg陽(yáng)性26例，HBeAg陰性，38例。使用APRI（aspartate aminotransferase to platelet ratio index），F(xiàn)IB-4(fibrosis-4)以及瞬間肝臟彈性測(cè)定（transient elastography）對(duì)上述病人進(jìn)行測(cè)定，使用受試者工作曲線下面積（AUC）評(píng)價(jià)這三種無(wú)創(chuàng)肝纖維化指標(biāo)或技術(shù)的診斷效應(yīng)

13、。
　　結(jié)果:APRI的檢測(cè)值在PNALT,PIALT1，PIALT2分別為0.32±0.14，0.61±0.44，1.25±0.62（F=284.92,P<0.001）;FIB-4在各組分別為0.72±0.36，1.12±0.53，1.67±0.84，（F=56.37，P<0.001） FibroScan檢測(cè)值LSM(KPa)為5.33±2.45，7.36±3.14，10.22±5.53（F=46.34,P<0.001）。PNA

14、LT,PIALT1和PIALT2中度以上炎癥壞死比率分別為16.81%（16/95）,32.56%(28/86)和45.31%（28/64）;中度以上肝纖維化比率分別為23.96%（23/95）,33.72%(29/86)和43.75%（28/64）;PIALT組炎癥壞死還是肝纖維化程度均較PNALT組嚴(yán)重（P均<0.05）。APRI對(duì)PNALT，PNALT1，PNALT2和所有病人的AUC分別為0.518（截?cái)嘀?.202，P=0.7

15、852）；0.659（截?cái)嘀?.524，P=0.011）；0.735（截?cái)嘀?.26，P<0.001）;0.65（截?cái)嘀?.15，P<0.001）。FIB-4對(duì)PNALT，PNALT1，PNALT2和所有病人的AUC分別為0.597（截?cái)嘀?.698，P=0.152）；0.642（截?cái)嘀?.174，P=0.021）；0.667（截?cái)嘀?.46，P=0.015）;0.659（截?cái)嘀?.96，P<0.001）。Fibroscan對(duì)PNALT

16、，PNALT1，PNALT2和所有病人的AUC分別為0.769（截?cái)嘀?.3，P<0.001）；0.8（截?cái)嘀?.5，P<0.001）；0.708（截?cái)嘀?.5，P=0.017）;0.763（截?cái)嘀?.5，P<0.001）。三種無(wú)創(chuàng)性肝纖維化指標(biāo)的診斷價(jià)值比較發(fā)現(xiàn)，在PNALT組LSM比較APRI和 FIB-4曲線下面積差均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）；在PIALT1組，無(wú)論APRI比較FIB-4，還是LSM比較APRI和 FIB-4

17、曲線下面積差均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）；同樣地，在PIALT2組，無(wú)論APRI比較FIB-4，還是LSM比較APRI和 FIB-4曲線下面積差也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）；對(duì)總體病人的比較，可以看到，僅有LSM比較APRI曲線下面積差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），APRI比較FIB-4或者LSM比較FIB-4均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。
　　結(jié)論:常用的血清學(xué)肝纖維化診斷指標(biāo)APRI和 FIB-4，對(duì)PNALT慢

18、性乙肝感染者不是理想的診斷模型，APRI和FIB-4根據(jù)常用的血液生化指標(biāo)建立，更適合ALT異常的慢性乙肝。而Fibroscan是通過(guò)測(cè)定肝臟硬度來(lái)判斷肝纖維化程度，由于受肝臟炎癥壞死的影響較大，雖然對(duì)無(wú)論 ALT增高與否均有較好的診斷效應(yīng)，但對(duì)ALT正常慢性乙肝其診斷效應(yīng)更高。
　　第三部分深度測(cè)序分析顯著肝組織損傷的PNALT慢性乙肝感染者的差異microRNA血清表達(dá)
　　目的:使用新一代深度測(cè)序檢測(cè)顯著肝組織學(xué)損傷的

19、PNALT慢性乙肝感染者的血清miRNA的差異表達(dá)
　　方法:使用Illumina Hisque2000對(duì)6例顯著肝組織學(xué)損傷（中度以上的炎癥壞死或者中度以上的肝纖維化）的PNALT慢性乙肝（SPNALT）,6例無(wú)顯著肝組織學(xué)損傷（輕度及以下的炎癥壞死或者輕度及以下的肝纖維化）的PNALT慢性乙肝（NSPNALT）和6例正常健康人（healthy control），操作步驟按照公司提供的流程進(jìn)行，所有Illumina Hisque

20、2000測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)og2，三組樣品間的兩兩比較使用卡方（chi-square）和精確概率法（fisher exact test）處理。篩選條件是倍數(shù)差異2倍以上和P<0.01。
　　結(jié)果:三組混合樣本（健康對(duì)照，NSPNALT和SPNALT）的Illumina Hisque2000測(cè)序的小RNA共分別產(chǎn)生7,896,608,8,580,434和7,485,507個(gè) raw-reads,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步處理和質(zhì)量控制，raw-rea

21、ds減少到494,523,659,447和441,182 clean reads。miRNA長(zhǎng)度集中分布在20~24nt，總共有2767個(gè)獨(dú)一的reads和人類miRNAs或者pre-miRNAs吻合。從SPNALT與健康對(duì)照比較，可以看出有143個(gè)miRNA有顯著性差異表達(dá)，其中有22個(gè)miRNAs4倍上調(diào)，且P<0.01，有4個(gè)miRNAs4倍下調(diào)，且P<0.01；從SPNALT與NSPNALT比較，可以看出有88個(gè)miRNA有顯著

22、性差異表達(dá)，其中有13個(gè)miRNAs4倍上調(diào)，且P<0.01，有21個(gè)miRNAs4倍下調(diào)，且P<0.01。
　　結(jié)論: Illumina Hisque2000測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了SPNALT與NSPNALT和健康對(duì)照組之間存在血清miRNA的差異表達(dá)，結(jié)果已經(jīng)被GEO(Gene Expression Omnibus)收錄，收錄號(hào)為G62290.
　　第四部分血清miRNA在SPNALT慢性乙肝感染者的診斷價(jià)值
　　目的:mi

23、RNA具有良好的生物標(biāo)記物特性，它們定義明確、化學(xué)結(jié)構(gòu)一致、便于物種化管理以及在細(xì)胞和循環(huán)中均穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)篩選驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)血清miRNA在SPNALT慢性乙肝感染者的診斷價(jià)值。
　　方法:創(chuàng)造性地運(yùn)用“四步篩選法”篩選上部分在發(fā)現(xiàn)階段采用新一代深度測(cè)序技術(shù)（Illumina Hiseq2000）發(fā)現(xiàn)的差異血清miRNA，再通過(guò)篩選階段，使用qRT-PCR的方法，選定內(nèi)參miRNA，建立均一的少量隊(duì)列篩選集（健康對(duì)照20例，NSPNA

24、LT20例，SPNALT20例），篩選出miRNA Ct value<35和detection rate>75%;p<0.05的miRNA。篩選出候選miRNA后，進(jìn)入訓(xùn)練階段（健康對(duì)照62例，NSPNALT72例，SPNALT65例），使用qRT-PCR對(duì)大樣本訓(xùn)練集檢驗(yàn)?zāi)康膍iRNA，并使用LogiticP建立miRNA模型。最后是驗(yàn)證階段（健康對(duì)照40例，NSPNALT55例，SPNALT53例），利用訓(xùn)練集建立的miRNA模型，

25、對(duì)獨(dú)立建立的隊(duì)列驗(yàn)證集進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)價(jià)其診斷價(jià)值。
　　結(jié)果: SPNALT vs總對(duì)照訓(xùn)練出候選miRNA7個(gè)，分別是hsa-miR-885-5p，hsa-miR-10a-5p，hsa-miR-511-5p，hsa-miR-574-5p，hsa-miR-98-5p，hsa-miR-26a-5p，hsa-miR-30b-5p; SPNALT vs Healthy訓(xùn)練出候選miRNA6個(gè)，分別是hsa-miR-885-5p，hsa-m

26、iR-122-5p，hsa-miR-574-5p，hsa-miR-26a-5p，hsa-miR-192-5p hsa-miR-30b-5p; SPNALT vs NSPNALT訓(xùn)練出候選miRNA5個(gè), hsa-miR-122-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-511-5p, hsa-miR-98-5p, hsa-miR-30b-5p。SPNALT區(qū)別健康對(duì)照組的LogisticP1=-4.0262-0.28851

27、XmiR_122-0.50803X miR_885+0.85701X miR_26a；SPNALT區(qū)別 NSPNALT組的LogisticP2=-43.5606+0.84629X miR_122+0.67945X miR_30b-0.29171X miR_511+0.56001X miR_98； SPNALT區(qū)別總對(duì)照組的LogisticP3=-15.5745-0.38122X miR_10a+0.27707X miR_30b-0.33

28、520X miR_885+0.88670X miR_98。SPNALT區(qū)別總對(duì)照組miRNA panel3的診斷價(jià)值:AUC=0.826(95%CI=0.775–0.878，sensitivity=70.8%, specificity=83.4%, p<0.01)；SPNALT區(qū)別健康組miRNA panel1的診斷價(jià)值:AUC=0.836;95%CI,0.775~0.897，sensitivity78.7%,specificity83

29、.3%, p<0.01);SPNALT區(qū)別NSPNALT組miRNA panel2的診斷價(jià)值:AUC=0.864，95%CI,0.813~0.916，sensitivity79.6%, specificity84.7%，p<0.01)。
　　結(jié)論:我們利用四步篩選法發(fā)現(xiàn)了可以區(qū)別于健康對(duì)照和無(wú)顯著肝組織損傷的PNALT的血清miRNA panels.
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1、大樣本、連續(xù)回顧前瞻性的研究了PNALT慢性乙