通過(guò)兔單克隆抗體篩選胚胎干細(xì)胞特異性分子標(biāo)志的研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES cells)是指從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離獲得的,能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并保持自我更新能力和分化為所有三個(gè)胚層細(xì)胞潛能的正常二倍體細(xì)胞。ES細(xì)胞是細(xì)胞治療和組織工程的理想種子細(xì)胞來(lái)源,可應(yīng)用于藥物篩選,還是很好的研究胚胎早期分化的模型系統(tǒng)。 胚胎干細(xì)胞的高度自我更新能力和分化全能性是它區(qū)別于其它細(xì)胞的重要特征,它的特異性分子標(biāo)志,對(duì)于胚胎干細(xì)胞的鑒定、分離以及自我更新和分化機(jī)制的研究

2、,有著十分重要的意義。尤其是細(xì)胞表面分子標(biāo)志,與細(xì)胞外信號(hào)系統(tǒng)和細(xì)胞間通訊聯(lián)系密切相關(guān),受到廣泛關(guān)注。但是目前發(fā)現(xiàn)的ES細(xì)胞分子標(biāo)志數(shù)量有限,而且與其他的成體干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞有共同的表達(dá),因此更多更特異的胚胎干細(xì)胞分子標(biāo)志仍有待發(fā)現(xiàn)。胚胎干細(xì)胞特異性分子,尤其是膜表面特異分子,具有豐度低、修飾復(fù)雜和變化快的特點(diǎn)；胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)復(fù)雜,不易大規(guī)模培養(yǎng),加之它的群體異質(zhì)性更增加了特異性分子標(biāo)志的研究難度。 目前研究胚胎干細(xì)胞特異性

3、分子標(biāo)志的方法主要基于單克隆抗體技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)和蛋白組學(xué)技術(shù)。我們實(shí)驗(yàn)室使用小鼠ES細(xì)胞免疫兔,篩選ES細(xì)胞特異的兔單克隆抗體,通過(guò)免疫共沉淀和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合的方法鑒定抗原來(lái)篩選胚胎干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志。目前常用的大部分胚胎干細(xì)胞分子標(biāo)志SSEA-1、SSEA-3、TRA-1-60等并不是直接從胚胎干細(xì)胞獲得的,而且所用的免疫動(dòng)物大多為小鼠。與鼠單抗相比,兔單抗具有更大的優(yōu)勢(shì)：首先,兔對(duì)外源抗原反應(yīng)更為敏感,可以對(duì)小鼠無(wú)免疫原性的抗

4、原產(chǎn)生抗體；其次,兔單克隆抗體具有更高的親和力；第三,對(duì)同一種抗原,兔單抗會(huì)識(shí)別更多不同的表位；第四,兔的脾臟更大,可以產(chǎn)生更多的脾細(xì)胞進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn),有機(jī)會(huì)篩選到更多的單克隆抗體。通過(guò)ES細(xì)胞免疫兔的方法可以獲得大量分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株從而建立胚胎干細(xì)胞的抗體庫(kù),并可能率選到新的胚胎干細(xì)胞分子標(biāo)志。 在本次實(shí)驗(yàn)中,我們共篩選到了200多株胚胎干細(xì)胞特異性的雜交瘤,并選擇了其中20株進(jìn)一步進(jìn)行亞克隆,最后獲得了14株穩(wěn)定分

5、泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。大部分抗體對(duì)胚胎干細(xì)胞有特異性結(jié)合,并且具有一定的組織表達(dá)特異性。細(xì)胞免疫熒光和免疫組織化學(xué)得結(jié)果顯示：多數(shù)抗體具有較高的特異性,僅在少數(shù)成體組織或其它細(xì)胞系中有染色現(xiàn)象,并且多數(shù)抗體的染色在ES細(xì)胞分化后會(huì)出現(xiàn)染色變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象,說(shuō)明這些抗體所針對(duì)的抗原隨著ES的分化表達(dá)降低,這些抗原很有可能會(huì)成為未分化胚胎細(xì)胞的分子標(biāo)志。尤其是其中-株雜交瘤59＃,它所分泌的抗體只在ES細(xì)胞中有陽(yáng)性染色,其抗原在成體組