西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的原核表達(dá)及其特異性單克隆抗體的研制.pdf

1、西尼羅河病毒(WNV)在病毒學(xué)分類上屬于黃病毒科黃病毒屬日本腦炎病毒血清群，因于1937年首次從非洲烏干達(dá)西尼羅河地區(qū)一名發(fā)熱的婦女血液中分離到病毒而得名。自然條件下，病毒存在于鳥(niǎo)—蚊子—鳥(niǎo)的傳播循環(huán)中，其中以庫(kù)蚊為主。人、馬經(jīng)帶毒蚊蟲(chóng)的叮咬而感染，引發(fā)西尼羅河熱或西尼羅河病毒性腦炎。 根據(jù)已發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)針對(duì)NY99株西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ基因序列的特異性引物，以引進(jìn)的含WNVE蛋白基因的重組質(zhì)粒為模板，用聚合酶

2、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增WNVE蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因，大小為360bp。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-T/DⅢ，經(jīng)BamHI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收目的片段，克隆到pET-32a表達(dá)載體。通過(guò)PCR、酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)結(jié)構(gòu)域Ⅲ基因以正確的閱讀框架插入了pET-32a載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，運(yùn)用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物并用WesternBlot進(jìn)行鑒定

3、，結(jié)構(gòu)域Ⅲ融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為30.3×103。親和層析法從表達(dá)產(chǎn)物中純化目的蛋白，從而為制備WNV實(shí)驗(yàn)室診斷抗原和分析結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。 以純化的西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ重組融合蛋白為免疫原免疫BALB/c小鼠，運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，并采用間接ELISA方法進(jìn)行篩選，共獲得了3株能穩(wěn)定分泌針對(duì)西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4F7、6H3和8E4，其

4、單抗亞類鑒定分別屬于IgG1、IgG1和IgG2a。經(jīng)間接ELISA、免疫印跡和間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定，這3株單克隆抗體均能與重組西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ發(fā)生特異性反應(yīng)，而與日本腦炎病毒無(wú)交叉反應(yīng)，并且，8E4和6H3識(shí)別同一抗原位點(diǎn)，4F7識(shí)別西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的另一抗原位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)成功研制出針對(duì)西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的特異性單克隆抗體，為我國(guó)建立西尼羅河病毒的病原學(xué)檢測(cè)方法并與日本腦炎病毒進(jìn)行鑒別診斷提供了有力的技術(shù)貯備