不同梅花品種CBF-DREB1同源基因的克隆及功能分析.pdf

1、梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)是我國(guó)傳統(tǒng)名花之一，起源于中國(guó)，距今已有三千多年的引種栽培史。然而，北方尤其是北京和北緯高于40°的地區(qū)冬季的持續(xù)低溫以及干冷風(fēng)所引起的風(fēng)害限制梅花的生長(zhǎng)和發(fā)育。CBF轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答低溫脅迫中具有重要作用，為了揭示梅花CBF抗寒的分子調(diào)控機(jī)制，本研究以11個(gè)抗寒性存在差異的梅花品種，包括‘雪梅’、‘小宮粉’、‘小綠萼’、‘北京小’梅、‘雪月花’、‘送春’、‘豐后’、‘武藏野’、

2、‘花蝴蝶’、‘楊貴妃’和‘美人’梅為材料，克隆了10個(gè)梅花品種的PmCBFa，PmCBFb和PmCBFc序列，比較11個(gè)品種間序列的差異;挑選‘雪梅’、‘小綠萼’、‘送春’、‘花蝴蝶’和‘美人’梅5個(gè)品種，分析低溫脅迫下PmCBFa、PmCBFb和PmCBFc表達(dá)模式的差異，檢測(cè)‘小綠萼’、‘送春’和‘美人’梅3個(gè)品種中其他5個(gè)PmCBF同源基因表達(dá)模式的差異，及‘花蝴蝶’PmhCBFs對(duì)其他非生物脅迫的響應(yīng);并轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabid

3、opsisthaliana)驗(yàn)證不同品種PmCBFa、PmCBFb和PmCBFc基因功能的差異;探討了‘花蝴蝶’PmhCBFc提高擬南芥抗寒性的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:
　　1、結(jié)合同源克隆與FNPI-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到了10個(gè)抗寒性存在差異的梅花品種的PmCBFa、PmCBFb和PmCBFc全長(zhǎng)序列。氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn):PmCBFs編碼的氨基酸序列均含有核定位信號(hào)(NLS)、AP2結(jié)構(gòu)域、DSAWR和LWSY保守序列，氨

4、基酸序列保守性高，11個(gè)品種的PmCBFa、PmCBFb與PmCBFc只存在單氨基酸位點(diǎn)的差異，保守結(jié)構(gòu)域的差異更小。說(shuō)明梅花PmCBFa、PmCBFb與PmCBFc編碼區(qū)在進(jìn)化過(guò)程中，承受著強(qiáng)大的選擇壓。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，Prunus屬與擬南芥CBF蛋白沿著兩大分支方向進(jìn)化。Prunus屬的CBFs基因都聚在一個(gè)亞組，表明PmCBFs基因是Prunus屬的典型代表。
　　2、用qRT-PCR技術(shù)分析‘雪梅’、‘小綠萼’、‘送春’

5、、‘花蝴蝶’和‘美人’梅5個(gè)品種PmCBFa、PmCBFb和PmCBFc低溫脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明:5個(gè)梅花品種PmCBFa、PmCBFb和PmCBFc基因均能響應(yīng)低溫脅迫，但表達(dá)豐值與品種抗寒性之間無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性。為尋找與品種抗寒性相關(guān)的PmCBF基因，進(jìn)一步檢測(cè)‘小綠萼’、‘送春’、‘美人’梅3個(gè)品種其他5個(gè)CBF同源基因在低溫脅迫下的表達(dá)水平，結(jié)果顯示抗寒性強(qiáng)的‘送春’和‘美人’梅5個(gè)基因的表達(dá)量顯著高于‘小綠萼’品種。另外，還

6、分析了‘花蝴蝶’PmhCBFs對(duì)各種非生物脅迫處理的響應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PmhCBFs對(duì)各種非生物脅迫都有響應(yīng)，但響應(yīng)程度不同，PmhCBFa和PmhCBFb更響應(yīng)低溫脅迫，而PmhCBFc更響應(yīng)H2O2脅迫。
　　3、根據(jù)CBF/DREB1氨基酸序列分析的結(jié)果，分別構(gòu)建了‘雪梅’、‘花蝴蝶’、‘送春’和‘美人梅’PmCBFa、PmCBFb與PmCBFc超量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果顯示，PmCBFs在擬南芥中的超量表達(dá)提高

7、了轉(zhuǎn)化植株的抗寒性，且轉(zhuǎn)化植株的抗寒性與PmCBFs基因在轉(zhuǎn)化株系中的表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系。
　　4、對(duì)PmhCBFc超表植株和野生型擬南芥進(jìn)行ROS組織化學(xué)染色，分析了PmhCBFc基因提高擬南芥抗寒性與活性氧的關(guān)系。甲基紫精(MV)處理以及抗氧化物酶活性檢測(cè)顯示，超表PmhCBFc擬南芥植株在凍融循環(huán)過(guò)程中的抗氧化能力提高，RT-PCR結(jié)果表明這種抗氧化能力的增加可能與AtCSD2的上調(diào)表達(dá)有關(guān)，這些結(jié)果展示PmhCBFc可能通