番茄生長(zhǎng)素受體同源基因SITIR1的克隆與功能分析.pdf

1、生長(zhǎng)素是一種重要的植物內(nèi)源激素，由產(chǎn)生部位轉(zhuǎn)移到作用部位，并以極低的濃度影響植物細(xì)胞的分化、分裂、伸長(zhǎng)、發(fā)育及植物整體形態(tài)的建立、生理生化活動(dòng)等。生長(zhǎng)素信號(hào)如何被植物接收并對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用，其中一個(gè)十分關(guān)鍵的因子就是生長(zhǎng)素受體。因而，生長(zhǎng)素受體一直是生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的一大熱點(diǎn)。但由于過(guò)去很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)在生長(zhǎng)素受體領(lǐng)域的研究一直停滯不前，所以極大地阻礙了生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及作用機(jī)制的研究。近二十年的研究結(jié)果表明，TIRl(

2、transport inhibitor response I)編碼一個(gè)F-box蛋白，該蛋白與其他幾種蛋白在植物體內(nèi)組裝成SCFTIRl蛋白復(fù)合體，SCFTIRl對(duì)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)是必需的，但是，對(duì)于TIR1基因的功能一直沒(méi)有得到確證。2005年，Dharmasiri和Kepinski等人的研究證明TIR1直接與生長(zhǎng)素結(jié)合，并確定TIR1是擬南芥中生長(zhǎng)素的受體，從而引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。隨后對(duì)生長(zhǎng)素受體同源基因家族成員的AFBl-A

3、FB3的研究表明，TIR1及其同源家族成員作為生長(zhǎng)素受體在生長(zhǎng)素介導(dǎo)的植物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 番茄作為典型的躍變型果實(shí)，其生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟過(guò)程的表觀特征變化非常明顯，加之遺傳背景較為清楚，基因組小而且生長(zhǎng)周期短，因而成為研究果實(shí)發(fā)育及成熟過(guò)程的重要模式材料。大量研究結(jié)果證實(shí)，生長(zhǎng)素幾乎參與番茄生長(zhǎng)和發(fā)育的各個(gè)方面。近年來(lái)，對(duì)生長(zhǎng)素調(diào)控果實(shí)發(fā)育過(guò)程的研究報(bào)道明顯增多，但是至今沒(méi)有關(guān)于番茄生長(zhǎng)素受體基因的分離及其參與

4、植物生長(zhǎng)和果實(shí)發(fā)育的報(bào)道。所以，開(kāi)展番茄生長(zhǎng)素受體基因功能的研究將對(duì)深入闡明生長(zhǎng)素在番茄發(fā)育過(guò)程的調(diào)控機(jī)理具有重要意義。
　　 為了研究SlTIR1的生物學(xué)功能，本研究開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的研究：
　　 (1)利用番茄EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息，通過(guò)電子克隆技術(shù)和RACE技術(shù)克隆了番茄TIR1同源基因，命名為SlTIRl；生物信息學(xué)分析結(jié)果表明SlTIR1與AtTIRl的蛋白序列具有很高的同源性，其次分別與AtGRHl、At

5、AFB2、AtAFB3，一致性/相似性分別為77％/89％、66％/80％、59％/75％、60％/75％。對(duì)蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果顯示，SlTIR1與AtTIRl都含有一個(gè)F-box結(jié)構(gòu)域和六個(gè)亮氨酸富集重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域。
　　 (2)采用半定量PCR方法，以番茄的根(root)、莖(stem)、葉(leave)、花(flower)、未成熟綠期果實(shí)(immature green)、成熟綠期果實(shí)(mature green)

6、、破色期果實(shí)(breaker)、紅熟期(ripe red)果實(shí)等不同組織為材料，對(duì)SlTIR1基因進(jìn)行了組織表達(dá)分析，結(jié)果表明，SlTIR1在各種組織中都有表達(dá)，但在花中表達(dá)最強(qiáng)，根中表達(dá)最弱；為了進(jìn)一步明確SlTIR1基因在花中的表達(dá)特征，以開(kāi)花前2天、開(kāi)花期和開(kāi)花后4天的子房、雄蕊、花瓣、萼片為材料，采用定量PCR方法對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，SlTIR1在花蕾期到開(kāi)花期的各種花的組成部分中都有表達(dá)。從花蕾期到開(kāi)花期，萼片中

7、SlTIR1表達(dá)量升高，而雄蕊中SlTIR1表達(dá)量急劇下降。從開(kāi)花期到開(kāi)花后4天(果實(shí)開(kāi)始形成)，子房和萼片中SlTIR1表達(dá)量都降低。由此推測(cè)，花期SlTIR1表達(dá)水平的變化可能與果實(shí)形成過(guò)程密切相關(guān)。
　　 (3)為了明確番茄SlTIR1蛋白的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了CaMV35S: SlTIRl-GFP融合表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示SlTIR1定位于細(xì)胞核中。
　　 (4)根據(jù)SlTIR1

8、基因cDNA序列及番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息，克隆了SlTIR1基因啟動(dòng)子序列，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子中可能的調(diào)控元件，利用相應(yīng)的激素處理幼苗，用定量PCR方法檢測(cè)了SlTIRl基因在各種激素處理前后轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明，Ethephon和ABA處理番茄幼苗2h，SlTIRl基因的表達(dá)下調(diào)；NAA和GA處理幼苗2h，SlTIR1的表達(dá)上升；結(jié)果表明，番茄幼苗中SlTIR1基因表達(dá)受NAA、GA的正調(diào)控，受Ethyphon、

9、ABA的負(fù)調(diào)控。
　　 (5)為了深入研究SlTIR1基因的功能，構(gòu)建了SlTIR1基因超表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化番茄，通過(guò)對(duì)SlTIR1超表達(dá)植株形態(tài)學(xué)特征分析結(jié)果表明，SlTIR1基因超表達(dá)導(dǎo)致番茄單性結(jié)實(shí)和葉片形態(tài)的改變；同時(shí)，SlTIR1超表達(dá)后改變了生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄水平。生理學(xué)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)表明，SlTIR1基因在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和番茄果實(shí)形成過(guò)程中起著正調(diào)控作用。本論文的研究結(jié)果為闡明果實(shí)單性結(jié)實(shí)的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。