轉(zhuǎn)基因白樺中外源基因整合表達(dá)穩(wěn)定性與遺傳變異分析.pdf

1、本研究分析了由農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因白樺的細(xì)胞學(xué)水平變異情況，同時(shí)用RAPD標(biāo)記方法對(duì)轉(zhuǎn)基因白樺在分子水平的變異情況進(jìn)行了分析，并根據(jù)多態(tài)性指數(shù)與其他轉(zhuǎn)基因植物的變異作了比較研究。本研究還進(jìn)一步深入研究外源基因在轉(zhuǎn)基因白樺中的整合特性及對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響、目的基因和標(biāo)記基因(及報(bào)告基因gus)的整合與表達(dá)的相關(guān)性和穩(wěn)定性。結(jié)果如下： 1.采用常規(guī)SDS方法、改良SDS法、常規(guī)CTAB法、高鹽CTAB法和改良的CTAB法對(duì)富含多糖

2、的白樺成熟葉片DNA進(jìn)行提取，并對(duì)得到的DNA進(jìn)行電泳分析和含量測(cè)定，結(jié)果表明改良的CTAB法所提取的DNA純度高，質(zhì)量較好，用限制性內(nèi)切酶酶切后條帶均一，證明該方法適于提取白樺成熟葉片的基因組DNA，能滿足進(jìn)一步分析的要求。 2.應(yīng)用細(xì)胞學(xué)方法分析了由農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因白樺的細(xì)胞學(xué)變異情況，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因白樺的染色體變異頻率為78.5％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)基因白樺的變異頻率(15.3％)，且變異以非整倍體占多數(shù)。同時(shí)用RAPD

3、標(biāo)記方法研究了轉(zhuǎn)基因白樺在DNA水平的變異情況，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因苗群體中，14個(gè)引物共檢測(cè)到90個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)57個(gè)，占63.33％;腋芽增殖組培苗群體中檢測(cè)到的90個(gè)位點(diǎn)中，14個(gè)為多態(tài)位點(diǎn)，占全部位點(diǎn)的15.6％。按檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)比率排序，二者順序?yàn)椋恨D(zhuǎn)基因苗TR＞腋芽增殖組培苗CK。轉(zhuǎn)基因苗TR與腋芽增殖組培苗CK間的遺傳距離為0.6502，相似系數(shù)為0.5219。由此可以看出兩群體間有一定程度的變異產(chǎn)生。這些都說明了轉(zhuǎn)基

4、因白樺產(chǎn)生的DNA變異顯著高于組培苗對(duì)照。DNA多態(tài)性指數(shù)為31.67，并與其它轉(zhuǎn)基因植物的變異情況作了比較研究。 3.跟蹤研究30個(gè)轉(zhuǎn)基因白樺無性系中的目的基因整合的穩(wěn)定性，結(jié)果表明目的基因在三年中均穩(wěn)定存在。這30株轉(zhuǎn)基因白樺中有28株的gus基因能夠穩(wěn)定表達(dá)，占總數(shù)的93.3％。 4.利用HpaI單酶切轉(zhuǎn)基因白樺基因組DNA，通過Southern雜交確定目的基因在轉(zhuǎn)基因抗蟲白樺中的拷貝數(shù)(或整合位點(diǎn)數(shù))。結(jié)果顯示，

5、在供試的21株轉(zhuǎn)基因白樺中拷貝數(shù)較低介于1-8個(gè)之間。其中有四株為單拷貝整合，一株為兩拷貝，四株為三拷貝，其余為五至八拷貝。bt基因在單拷貝和多拷貝植株間均有轉(zhuǎn)錄水平沉默發(fā)生，這說明外源基因的轉(zhuǎn)錄水平沉默與其拷貝數(shù)之間沒有必然聯(lián)系。且bt表達(dá)具有一定的時(shí)序性，即從5月至8月表達(dá)量逐漸降低。 5.在20株轉(zhuǎn)基因白樺中g(shù)us、nptⅡ、bt三個(gè)基因均已整合，三個(gè)基因的共整合頻率達(dá)100％。在10個(gè)無性系中只有6個(gè)無性系的gus、np