IGF-I轉(zhuǎn)基因羊基因穩(wěn)定性分析.pdf

1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在，經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展過程，特別是近十年來，更是有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。研究人員對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的要求已經(jīng)從最初的獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)化成為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類優(yōu)質(zhì)生活服務(wù)的目標(biāo)上來。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為類胰島素樣生長(zhǎng)因子 I（IGF-I）轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊及其后代，以導(dǎo)入到宿主體內(nèi)的外源基因 IGF-I為研究目標(biāo)，通過對(duì) IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊外源基因的整合位點(diǎn)、拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行研究，旨在為外源基因的功能研究

2、奠定基礎(chǔ)，為轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊的高效生產(chǎn)提供借鑒。
　　方法：試驗(yàn)一：對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的 IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊及其后代進(jìn)行陽性個(gè)體鑒定。根據(jù)外源基因質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用 PCR法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊進(jìn)行陽性個(gè)體鑒定。試驗(yàn)二：利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物，對(duì)鑒定結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)三：通過相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊皮膚組織 IGF-I mRNA表

3、達(dá)水平進(jìn)行分析。試驗(yàn)四：利用 Western免疫印跡法，通過對(duì)外源基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊皮膚組織及內(nèi)臟蛋白的表達(dá)定量分析，對(duì)外源基因翻譯水平進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)五：采用染色體步移技術(shù)，提取轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊基因組 DNA，對(duì)外源基因在 IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊基因組 DNA上的整合位點(diǎn)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：試驗(yàn)一：結(jié)果表明：轉(zhuǎn) IGF-I基因細(xì)毛羊0152、0016、118、0217四只細(xì)毛羊均為 IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊。試驗(yàn)二：結(jié)果表明：IGF-

4、I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152、0016、118、0217外源基因的拷貝數(shù)分別為3、1、1、1。實(shí)驗(yàn)三：結(jié)果表明：IGF-I基因在皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量在 IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152、0016、118、0217分別為對(duì)照組細(xì)毛羊相對(duì)表達(dá)量的2.87倍、2.03倍、1.86倍和1.85倍，差異均極顯著（P<0.01）。轉(zhuǎn)基因原代羊0016皮膚組織中 IGF-I基因的表達(dá)量分別是一代羊118和0217的178.9％倍和150%，差異極顯著（P<

5、0.01）；轉(zhuǎn)基因原代羊0152 IGF-I基因在皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量分別是其后代118和0217的207%和174%，差異極顯著（P<0.01）。原代羊0152與0016皮膚組織中 IGF-I基因的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）；一代羊118和0217皮膚組織中的 IGF-I基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)四：結(jié)果表明：IGF-I蛋白在 IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152、0016、118、0217皮膚組織的相對(duì)表達(dá)

6、量分別為1.55、1.08、0.55、0.62，其表達(dá)量分別為相同年齡普通細(xì)毛羊的213%、187%、129%、127%，差異均極顯著（P<0.01）。IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152內(nèi)臟器官 IGF-I蛋白表達(dá)與普通細(xì)毛羊比較結(jié)果顯示：IGF-I蛋白在轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和皮膚的相對(duì)表達(dá)量分別為0.348、2.571、0.863、0.731、0.316、0.124、0.481，普通細(xì)毛羊 IGF-I蛋白相對(duì)表達(dá)

7、量在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和皮膚相對(duì)表達(dá)量分別為0.357、2.564、0.847、0.727、0.304、0.127、0.215，除在皮膚組織 IGF-I蛋白相對(duì)表達(dá)量 IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152為普通細(xì)毛羊223.8%，差異極顯著（P<0.01），其余組織器官IGF-I蛋白的相對(duì)表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152和普通細(xì)毛羊之間差異不顯著（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)五：結(jié)果表明：外源基因插入位點(diǎn)在 IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152