轉(zhuǎn)基因白樺中外源基因表達(dá)及其主要影響因素研究.pdf

1、本文以自然環(huán)境條件下生長(zhǎng)的4-5年生轉(zhuǎn)基因白樺(Betula platyphylla)為研究材料，通過(guò)Northern雜交與半定量RT-PCR方法對(duì)外源基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合外源基因的整合特性以及外源基因啟動(dòng)子和編碼區(qū)DNA甲基化情況等主要影響表達(dá)的因素進(jìn)行分析，所得結(jié)果如下：
　　1.在檢測(cè)的23株轉(zhuǎn)基因白樺（bt和蜘蛛殺蟲(chóng)肽嵌合基因（本文中簡(jiǎn)稱bt），nptⅡ和gus）中，nptⅡ基因全部穩(wěn)定表達(dá)，占總數(shù)的100％;1

2、8株gus基因穩(wěn)定表達(dá)，占總數(shù)的78.3％;18株bt基因穩(wěn)定表達(dá)，占總數(shù)的78.3％。這些植株在三年間表達(dá)穩(wěn)定，從5月份到9月份（包括5月和9月）的檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，外源基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。另外，同一植株的不同組織器官中外源基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在差異，葉＞雄花和雌花＞枝皮和木質(zhì)部＞根。
　　2.gus基因的檢測(cè)結(jié)果表明，植株TP96、TP74、TP73、TP30、TP28發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平沉默;TP67和TP46發(fā)生轉(zhuǎn)錄后

3、水平沉默。
　　3.在供試的22株轉(zhuǎn)基因白樺中，bt基因單拷貝的4株、2個(gè)拷貝2株、3個(gè)拷貝12株、4個(gè)拷貝2株。其中54.5％的植株為3個(gè)拷貝，68％的植株bt基因與gus基因的拷貝數(shù)不一致，且外源基因的沉默與T-DNA拷貝數(shù)聯(lián)系不緊密。另外，在檢測(cè)的28株轉(zhuǎn)基因白樺中大部分都含有載體序列（某段或全部），不含載體序列的3株僅占總數(shù)的10.7％。
　　4.甲基化敏感酶的限制性內(nèi)切酶結(jié)合Southern雜交分析法和亞硫酸鹽測(cè)序