CD28拮抗性類(lèi)肽、CD137結(jié)合肽的篩選及生物活性測(cè)定.pdf

1、第一部分 CD28拮抗性類(lèi)肽的篩選及其生物活性測(cè)定 目的： CD28-B7是T細(xì)胞活化最關(guān)鍵的，研究最清楚的協(xié)同刺激通路。阻斷CD28-B7通路是治療自身免疫病及防治移植排斥的重要策略之一。 目前阻斷協(xié)同刺激通路的方法主要是用特異性單克隆抗體封閉，如用抗B7的單抗(抗-CD80/86)阻斷CD28-B7通路，由于現(xiàn)有的單抗主要是鼠源性的，用于人體后可產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引起過(guò)敏反應(yīng)和療效的降低，而人單抗制備困難，

2、基因工程產(chǎn)品技術(shù)要求和造價(jià)高，限制了其在臨床的應(yīng)用。因此，迫切需要研發(fā) 出更為廉價(jià)、有效的阻斷劑。 類(lèi)肽是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型小分子受體或酶的阻斷劑，可與受體的配 體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，阻斷受體與天然配體的結(jié)合，起到受體抑制物的作用。類(lèi)肽可根據(jù)受體或酶結(jié)合位點(diǎn)的三維空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并通過(guò)組合化學(xué)的方法合成。其優(yōu)點(diǎn) 是有高度的受體親和力和選擇性，在體內(nèi)代謝穩(wěn)定，制備簡(jiǎn)單，成本低。 本研究的目的是針對(duì)CD28與其配體結(jié)合的

3、特異活性位點(diǎn)，用組合化學(xué)的方CD28拮抗性類(lèi)肽；利用噬菌體展示系統(tǒng)展示具有天然結(jié)構(gòu)的CD28同源 二聚體，以此建立一個(gè)簡(jiǎn)單、有效、高通量的體外篩選體系；以噬菌體展示CD28為靶標(biāo)，篩選與CD28高親和力結(jié)合的類(lèi)肽藥物；在體內(nèi)外進(jìn)一步檢測(cè)CD28拮 抗性類(lèi)肽藥物的生物活性，為CD28拮抗性類(lèi)肽藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．CD28拮抗性類(lèi)肽設(shè)計(jì)、合成 根據(jù)CD28的三維空間結(jié)構(gòu)及與B7結(jié)合關(guān)鍵基序，設(shè)計(jì)、

4、合成CD28拮抗性類(lèi)肽藥物，以SYBYL7.0軟件分析類(lèi)肽藥物與CD28結(jié)合空間結(jié)構(gòu)。此項(xiàng)工作主要由本課題合作單位山東大學(xué)藥學(xué)院完成。 2．CD28拮抗性類(lèi)肽篩選平臺(tái)的建立—以噬菌體展示具有天然生物活性的CD28靶標(biāo) RT-PCR從Jurkat細(xì)胞擴(kuò)增CD28胞外區(qū)，將其克隆入噬菌粒載體pComb3HSS，構(gòu)建的重組載體pComb3HSS—CD28電轉(zhuǎn)入受體菌XLl-Blue，并加輔助噬菌體VCSMl3，使CD28胞外區(qū)

5、同二聚體展示在噬菌體表面。以ELISA、流式細(xì)胞儀檢測(cè)噬菌體展示CD28的抗原性和與B7-1的結(jié)合力。MTT法檢測(cè)噬菌體展示CD28對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制活性。 3.以噬菌體展示的CD28為靶標(biāo)，對(duì)CD28拮抗性類(lèi)肽進(jìn)行篩選 (1).CD28拮抗性類(lèi)肽體外非細(xì)胞篩選體系的建立 以噬菌體展示CD28為靶標(biāo)，建立CD28拮抗性類(lèi)肽體外非細(xì)胞篩選體系，即競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)：先將類(lèi)肽藥物與CD28噬菌體一起孵育后，然后

6、將二者的混合物加入包被有抗CD28Ab(或B7)的酶標(biāo)板上，如果類(lèi)肽藥物能與CD28噬菌體結(jié)合，則可抑制CD28噬菌體與酶標(biāo)板上抗CD28Ab(或B7)的結(jié)合，OD值的高低反應(yīng)類(lèi)肽藥物與CD28的結(jié)合的能力，二者呈反比關(guān)系。 (2).CD28拮抗性類(lèi)肽藥物與CD28噬菌體結(jié)合的特異性檢測(cè) 包括藥物濃度梯度依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度類(lèi)肽藥物與CD28噬菌體結(jié)合的能力；和噬菌體濃度梯度依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相同濃度類(lèi)肽藥物與不同

7、稀釋度的CD28噬菌體結(jié)合的能力。 4．CD28拮抗性類(lèi)肽體外生物活性檢測(cè) 以類(lèi)肽藥物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)影響，檢測(cè)類(lèi)肽藥物對(duì)CD28-B7協(xié)同刺激通路的阻斷效應(yīng)，包括： (1).<'3>H-TdR法檢測(cè)類(lèi)肽藥物對(duì)抗CD28Ab刺激的人T細(xì)胞增殖反應(yīng)影響 (2).<'3>H-TdR法檢測(cè)類(lèi)肽藥物對(duì)抗CD28Ab刺激的小鼠T細(xì)胞增殖反應(yīng)影響 (3).<'3>H-TdR法檢測(cè)類(lèi)肽藥物對(duì)小鼠混合

8、淋巴細(xì)胞反應(yīng)影響 5．以小鼠GVHD模型檢測(cè)類(lèi)肽藥物體內(nèi)生物活性。 以C57BL/6為供體鼠，BALB/c為受體鼠，建立小鼠GVHD動(dòng)物模型，并以此模型進(jìn)一步檢測(cè)CD28拮抗性類(lèi)肽藥物對(duì)GVHD的抑制效應(yīng)。 結(jié)果： 1．CD28拮抗性類(lèi)肽藥物設(shè)計(jì)、合成 根據(jù)CD28空間結(jié)構(gòu)及與B7結(jié)合關(guān)鍵基序，以SYBYL7.0軟件計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)與CD28結(jié)合類(lèi)肽藥物，并以組合化學(xué)方法合成了19種與CD28結(jié)合

9、的類(lèi)肽藥物。 2．CD28拮抗性類(lèi)肽篩選平臺(tái)的建立一以噬菌體展示具有天然生物活性的CD28靶標(biāo) 成功構(gòu)建表達(dá)人CD28分子胞外區(qū)同二聚體的重組噬菌粒載體pComb3H-CD28，并以噬菌體展示系統(tǒng)展示CD28分子。ELISA和FCM結(jié)果顯示，噬菌體展示CD28可與包被在酶標(biāo)板上的抗CD28抗體特異性結(jié)合，也可與Jurkat細(xì)胞表面CD28競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗CD28抗體，具有CD28抗原性。噬菌體展示CD28可與包被在酶標(biāo)板上的B

10、7-1特異性結(jié)合，也可與Raji細(xì)胞表面CD80結(jié)合，具有與配體結(jié)合能力。體外生物活性實(shí)驗(yàn)顯示，噬菌體展示CD28可抑制抗CD28抗體刺激的人外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。結(jié)果表明噬菌體展示CD28具有抗原性及生物活性，可用于CD28拮抗性類(lèi)肽藥物的篩選。 3．以噬菌體展示的CD28為篩選體系，對(duì)CD28拮抗性類(lèi)肽進(jìn)行篩選 以抗CD28Ab包被酶標(biāo)板的競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CD28噬菌體可以高親和力與酶標(biāo)板上的抗CD28

11、Ab結(jié)合，分別將10ug的1-19號(hào)類(lèi)肽藥物與CD28噬菌體混合后，則不同程度抑制了CD28噬菌體與酶標(biāo)板上抗CD28Ab的結(jié)合，其中7和9號(hào)藥物與CD28噬菌體的結(jié)合力較好。以9號(hào)類(lèi)肽藥物進(jìn)行的類(lèi)肽藥物與CD28噬菌體結(jié)合的特異性檢測(cè)顯示，類(lèi)肽藥物與CD28噬菌體的結(jié)合有藥物濃度依賴(lài)性和噬菌體濃度梯度依賴(lài)性。 4．CD28拮抗性類(lèi)肽體外生物活性檢測(cè) (1).人外周血T細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入不同濃度的9號(hào)或7號(hào)

12、類(lèi)肽藥物與PHA和抗CD28Ab聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，T細(xì)胞增殖明顯低于PHA+CD28Ab刺激組，說(shuō)明類(lèi)肽藥物可與淋巴細(xì)胞表面CD28結(jié)合，從而抑制抗CD28Ab對(duì)T細(xì)胞的協(xié)同刺激效應(yīng)。 (2).小鼠和人CD28與配體結(jié)合的關(guān)鍵序列完全相同，因而，與人CD28結(jié)合的類(lèi)肽也能與小鼠的CD28結(jié)合。同時(shí)，藥物的體內(nèi)試驗(yàn)首先需要在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，為進(jìn)一步研究類(lèi)肽藥物的生物活性，我們首先在體外以<'3>H-TdR法檢測(cè)了類(lèi)肽藥物對(duì)抗CD28抗體

13、刺激的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)影響。結(jié)果顯示，不同濃度的9號(hào)類(lèi)肽藥物與抗CD3Ab和抗CD28Ab聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，C57BL/6小鼠的T細(xì)胞增殖明顯低于抗CD3Ab和抗CD28Ab刺激組。 (3).GVHD為供體的淋巴細(xì)胞對(duì)受體的MHC分子的應(yīng)答。阻斷CD28-B7途徑是防治GVHD反應(yīng)的理想靶點(diǎn)。我們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)選擇的動(dòng)物模型為小鼠GVHD，因而，首先在體外檢測(cè)了類(lèi)肽藥物對(duì)供受體鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)

14、。小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示，一定量的9號(hào)類(lèi)肽藥物可在體外阻斷CD28共刺激信號(hào)，從而減輕BALB/C與C57BL/6的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。 5．以小鼠GVHD模型檢測(cè)類(lèi)肽藥物體內(nèi)生物活性。 以小鼠GVHD為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，進(jìn)一步檢測(cè)CD28拮抗性類(lèi)肽對(duì)GVHD的抑制效應(yīng)。供體鼠為C57BL/6，受體鼠為BALB/c。結(jié)果顯示：類(lèi)肽藥物治療可在早期減輕小鼠異基因骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞移植后GVHD的臨床癥狀；可在早期延長(zhǎng)GV

15、HD小鼠的生存時(shí)間，但對(duì)長(zhǎng)期成存率無(wú)明顯影響；類(lèi)肽藥物可減輕GVHD小鼠肝臟和結(jié)腸病理?yè)p傷。 結(jié)論及創(chuàng)新性 1．本研究在國(guó)內(nèi)外首次提出以小分子類(lèi)肽藥物阻斷協(xié)同刺激通路抑制T細(xì)胞的活化防治自身免疫病及移植排斥反應(yīng)，并根據(jù)CD28的空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成了與CD28結(jié)合的類(lèi)肽藥物。 2．在國(guó)內(nèi)外首次提出以噬菌體展示靶標(biāo)作為類(lèi)肽藥物的篩選平臺(tái)，并以噬菌體展示技術(shù)獲得了具有天然活性的CD28。以噬菌體展示CD28為靶標(biāo)建立了