從噬菌體7肽庫中篩選哇巴因特異性結合短肽并初步分析其生物學活性.pdf

1、目的：從噬菌體7肽庫中篩選與哇巴因特異性結合的短肽，并分析其生物學活性，為研究哇巴因與鈉泵的相互作用及防治內源性哇巴因相關的原發(fā)性高血壓奠定基礎。 方法： (1)哇巴因特異性結合短肽的篩選 ①親和篩選用哇巴因和卵清蛋白復合物包被酶標板，牛血清白蛋白封閉，快速洗板，加入稀釋噬菌體文庫，棄去未結合噬菌體，洗脫，收集洗脫液。將洗脫液加入大腸桿菌ER2738增殖培養(yǎng)。重復以上操作3次，獲得高度富集的噬菌體。 ②吸

2、附實驗用卵清蛋白包被酶標板，加入第3輪淘篩的噬菌體，收集未結合的噬菌體，測定滴度。重復3次后保存洗脫液。 ③滴度測定將3輪淘選產物與ER2738混合接種于IPTG-Xgal培養(yǎng)板上。計數(shù)培養(yǎng)板上的藍斑。 ④ELISA法鑒定用哇巴因與卵清蛋白復合物包被ELISA板的各孔，依次加入第3輪擴增后噬菌體、抗M13抗體和底物溶液H2O2，酶標儀測A450值。 ⑤噬菌體陽性克隆ssDNA的提取及測序分析，并推導出短肽序列，合

3、成多肽。 ⑥同源性分析：應用NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫，比較推導出的氨基酸序列同已知蛋白質的同源性。 (2)哇巴因結合肽生物學活性的檢測 ①采用放射性核素標記法測定3H-哇巴因與哇巴因結合肽的結合活性。 ②MTT比色法檢測哇巴因結合肽對哇巴因所致血管內皮細胞EAhy926生長抑制的影響。 ③形態(tài)學觀察：倒置光顯微鏡觀察細胞形態(tài)結構改變；Hoechst33342/PI雙熒光染色，熒光顯微鏡觀察細胞死

4、亡特征。 ④半定量RT-PCR法檢測哇巴因結合肽對哇巴因所致鈉泵α1亞單位、β1亞單位、VE-cadherin和Snail mRNA表達改變的影響。 結果： (1)從噬菌體7肽庫中篩選出與卵清蛋白-哇巴因藕聯(lián)物特異性結合肽的效率：第1輪：2.0×10-3％，第2輪：2.1×10-3％，第3輪：3.8％。使與卵清蛋白-哇巴因藕聯(lián)物特異性結合肽得到高度富集。2×1013pfu/ml的噬菌體庫經過3輪卵清蛋白包板吸附實

5、驗，特異地與哇巴因結合的噬菌體庫為1.8×102pfu/ml，經過3輪淘選并經ELISA鑒定，從噬菌體隨機7肽庫中篩選得到14個陽性克隆，對其ssDNA進行測序分析。篩選出3種多肽：肽A的篩選一致率達到64.3％(9/14)，共有堿基序列：CAACGTACTGGACGTCCACT，蛋白序列：RCMTSRS，同源蛋白：一種多蛋白復合體，位于其643-648位置，主要參與細胞的多種信號傳遞；肽B的篩選一致率為28.6％(4/14)，共有堿基

6、序列：GAGCGTTGGTGCATGGTGTG，蛋白序列：LATTVPH,同源蛋白：氨甲酰天冬氨酸脫水酶，位于其26-32位置；肽C的篩選一致率為7.14％(1/14)，共有堿基序列：TGCGTGTGTATGGATGG，蛋白序列：TATTIPT，同源蛋白：一種假象蛋白，位于其248-252位置。 (2)放射配基實驗結果：哇巴因結合肽能與3H-哇巴因結合，其回歸方程：B/F=-0.743B+94.5276(r=-0.768)，Kd

7、=0.836nmol/L，Bmax=127.7 fmol/mg蛋白。結果表明，3H-哇巴因與哇巴因結合肽(OCP)結合的平衡解離常數(shù)為0.836 nmol/L，受體密度為127.7 fmol/mg。 (3)哇巴因可抑制EAhy926細胞生長，且呈濃度-時間依賴性；高濃度哇巴因(10μmol/L)對細胞有劇烈抑制作用，而低濃度(0.001μmol/L)對細胞增殖的抑制作用明顯降低。經直線回歸計算24h、48h、72h IC50值分

8、別為0.507、0.126、0.038μmol/L。 (4)哇巴因結合肽拮抗作用：哇巴因結合肽可拮抗哇巴因對EAhy926細胞抑制生長作用，且呈濃度-時間依賴性；高濃度哇巴因結合肽(100μmol/L)對細胞有較強保護作用，而低濃度(0.001μmol/L)對細胞的保護作用則明顯降低。經直線回歸計算24h、48h、72h IC50值分別為0.612、0.364、0.174μmol/L。 (5)細胞形態(tài)學改變：EAhy92

9、6為貼壁生長型細胞，哇巴因作用后細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化。5-10/μmol/L哇巴因作用，12h后即引起細胞死亡，給予0.1μmol/L哇巴因干預24h，細胞由多角形變?yōu)閳A形，細胞間縫隙增大，細胞折光性減弱，隨著作用時間的延長，細胞出現(xiàn)腫脹、破碎、死亡。而10μmol/L哇巴因結合肽與0.1μmol/L哇巴因處理后，細胞死亡明顯減少。熒光顯微鏡下觀察證明，10μmol/L哇巴因處理細胞12h后有90％細胞劇烈壞死，被PI染成紅色；0.

10、1μmol/L哇巴因組細胞核染色質濃縮，呈亮珠狀，并形成凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學改變，而聯(lián)合組則凋亡細胞數(shù)量減少。 (6)哇巴因結合肽與0.1μmol/L哇巴因聯(lián)合對EAhy926細胞鈉泵α1和β1亞單位mRNA表達的影響：聯(lián)合實驗組與單獨使用0.1μmol/L哇巴因組作比較，聯(lián)合實驗組能下調EAhy926細胞鈉泵α1亞單位的表達，上調β1亞單位表達，且兩者均呈濃度依賴性。隨著哇巴因結合肽濃度的增加，鈉泵α1亞單位mRNA表達

11、明顯減弱；相反，β1亞單位mRNA表達增高。 (7)哇巴因結合肽與0.1μmol/L哇巴因聯(lián)合對EAhy926細胞VE-cadherin和Snail基因mRNA表達的影響：聯(lián)合實驗組與0.1/μmol/L哇巴因對照組比較，哇巴因結合肽能濃度依賴性地上調VE-cadherin表達、下調Snail表達。且二者的表達存在逆反關系，Snail在轉錄水平抑制VE-cadherin的表達。 結論： (1)從噬菌體7肽庫中得到

12、篩選一致率較高的哇巴因特異性結合短肽，其堿基序列為：CAACGTACTGGA CGTCCACT，蛋白序列為：RCMTSRS。 (2)哇巴因結合肽可以阻抑哇巴因對血管內皮細胞的抑制增殖和誘導死亡作用，其作用呈濃度-時間依賴關系。 (3)哇巴因結合肽可以阻抑哇巴因所致的血管內皮細胞鈉泵α1亞單位和Snail基因的表達上調及鈉泵β1亞單位和VE-cadherin的表達下調。這些分子的表達變化在血管內皮細胞的信號轉導和細胞黏附中