耐Cd細(xì)菌的篩選及抗性機(jī)理研究.pdf

1、重金屬污染是世界普遍存在的環(huán)境問題。修復(fù)和治理重金屬污染的研究中，微生物修復(fù)治理是一條有效的途徑，其中一個(gè)重要的工作即使從環(huán)境中篩選和獲得能耐受和高富集重金屬的微生物，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化而達(dá)到修復(fù)和治理環(huán)境中重金屬的目的。現(xiàn)代微生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展為此方面的研究提供了高效便利的手段。當(dāng)前相關(guān)研究的一個(gè)重點(diǎn)仍在于獲得重金屬高耐受和富集的微生物，并試圖從其機(jī)理上有所突破和利用。 本研究主要分兩部分，首先利用生物信息學(xué)

2、對(duì)將常見微生物的重要Cd相關(guān)蛋白-Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Cadmium Resistance Transporter)進(jìn)行同源比對(duì)及進(jìn)化分析。研究發(fā)現(xiàn)：Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列具有明顯的種屬特異性，來源于同一個(gè)屬的蛋白質(zhì)序列很好的聚類。葡萄球菌(Staphylococcus)Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬內(nèi)存在較大的差異，而芽孢桿菌屬(Bacillus)以及分枝桿菌屬(Mycobacterium)的蛋白序列有較好的保守性；它們都是4次以上跨細(xì)胞膜蛋白，這與跨膜

3、轉(zhuǎn)運(yùn)的功能一致，體現(xiàn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的統(tǒng)一。Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋，β-折疊和無規(guī)則卷曲，除B．cereus．R309803外，序列中最多的二級(jí)結(jié)構(gòu)是α-螺旋。從三級(jí)結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列折疊主要以藥物輸出轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB跨膜蛋白(multidrug efflux transporter AcrB transmembrane domain)為主，此種結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定、高效。 在生物信息分析的基礎(chǔ)上，對(duì)

4、Cd耐受或富集微生物進(jìn)行了篩選、優(yōu)化和鑒定，并對(duì)其Cd吸附及作用機(jī)理進(jìn)行了初步的研究和探討。采集來自成都郊區(qū)某化工廠排污口污泥，稀釋濃度后，利用Cd2+濃度梯度遞增法分離篩選。在200mg/L，Cd2+培養(yǎng)基上得到了一株具有較高抗性的菌株，結(jié)果如下： ·進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，生理生化實(shí)驗(yàn)，16SrDNA鑒定，菌株確定為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacea)。 ·該菌株生長速度快，環(huán)境要求低，能夠在M9培養(yǎng)基

5、上生長。經(jīng)過紫外誘變，對(duì)Cd的吸附能力提高9％，吸附量達(dá)到54mg/g。 ·菌株能在1500mg/L Cd2+液體培養(yǎng)基，400mg/L Cd2+固體培養(yǎng)基中生長。菌株的最佳生長條件是：pH6．4牛肉膏培養(yǎng)基，34℃培養(yǎng)，液體培養(yǎng)22—34h為宜。 ·菌株不含抗性質(zhì)粒，對(duì)Cd的抗性可能由基因組編碼。透射電鏡(TEM)觀察細(xì)菌吸附Cd后的變化，分析結(jié)果表明：吸附Cd2+后細(xì)胞表面粗糙，呈不規(guī)則的凸起，菌體膨大，周圍有沉

6、淀。細(xì)菌可能分泌某種化合物與Cd2+產(chǎn)生沉淀。細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不一的空泡，證明了Cd對(duì)細(xì)菌的毒害作用，菌體出現(xiàn)凋亡特征。陰溝腸桿菌耐鎘機(jī)理初步判斷為胞外沉淀。 最后經(jīng)查閱資料和實(shí)驗(yàn)分析得出以下結(jié)論：生物信息學(xué)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)有指導(dǎo)輔助作用；Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Cadmium Resistance Transporter)有明顯的種屬特異性和相類似的三級(jí)結(jié)構(gòu)；篩選得到陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacea)對(duì)Cd具有高耐受高富