骨髓干細胞優(yōu)化移植治療急性心肌梗死的實驗研究.pdf

1、目的:迄今為止,大多數(shù)臨床研究采用混雜的自體骨髓單個核細胞用于心肌再生治療,且尚無足夠證據(jù)表明某種特定干細胞的再生療效優(yōu)于其它種類干細胞。探索安全、符合倫理、且增殖分化潛能顯著的新型干細胞代表了心肌再生醫(yī)學(xué)未來的發(fā)展方向之一。極小類胚胎樣干細胞(VSELs)是近年來發(fā)現(xiàn)的成體多能干細胞,具有與胚胎干細胞相似的增殖分化潛能,有固定的表面抗原標記,且無免疫排斥及倫理爭議等問題,故可用于臨床。由于體積小,數(shù)量少,采用常規(guī)分選方法易損失大部分V

2、SELs。本研究擬探索VSELs的優(yōu)化分選方法,提高其分選效率并保持其生物學(xué)特性。
　　 方法:本實驗分為兩組。采用雄性C57BL/6小鼠,4-6周齡,分離股骨和脛骨,沖洗骨髓腔獲得小鼠全骨髓細胞。A組將全骨髓細胞接種培養(yǎng),經(jīng)換液去除懸浮細胞,培養(yǎng)至接種后第6-7天收集剩余細胞。B組將收集的全骨髓細胞經(jīng)裂解去除紅細胞后,得到骨髓單個核細胞。
　　 將以下熒光標記抗體預(yù)混并稀釋至相應(yīng)濃度:PE-Sca-1,FITC-CD4

3、5及APC—lineage(anti-CD45R/B220、anti-Gr-1、anti-TCRβ Chain、anti-CD11b及anti-Ter119)。收集A、B兩組細胞,加至抗體中孵育20分鐘；以密閉無菌的流式細胞儀分選VSELs[sca-1(+)/lineage(-)/CD45(-)]。透射電鏡下觀察VSELs超微結(jié)構(gòu),RT-PCR檢測相關(guān)基因表達水平。
　　 結(jié)果:兩組相比,A組經(jīng)短期體外培養(yǎng)后,骨髓干細胞中sca

4、-1(+)、CD45(-)亞群細胞比例(89.6±1.99％,22.9±1.84％)均顯著高于B組(16.53±0.54％,0.91±0.11％；P均<0.001)；A組lin(-)亞群細胞比例(51.1±3.6％)也顯著高于B組(34.7±3.0％,P=0.023)；A組分選得到的sca-1(+)/lin(-)/CD45(-)VSELs比例(9.4±0.62％)顯著高于B組(0.04±0.01％,P<0.001)。
　　 透射

5、電鏡掃描可見兩組分選的VSELs細胞大小、形態(tài)及內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)均無明顯差別,提示短期體外培養(yǎng)并未影響VSELs的生物學(xué)特性。定量RT-PCR結(jié)果顯示,A組細胞少量表達胚胎干細胞特異性基因Oct-4、Nanog,以及心肌細胞特異性基因Gata4、Nkx2.5；B組表達極低水平的Oct-4及Nanog,無Gata4、Nkx2.5基因表達。
　　 結(jié)論:全骨髓細胞短期體外培養(yǎng)能夠有效地擴增VSELs,并保持其生物學(xué)特性。
　　

6、目的:骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是移植治療急性心肌梗死理想的供體細胞之一,但心肌梗死后心肌局部微環(huán)境異常惡劣,不利于移植細胞在體存活并發(fā)揮作用。本課題組前期研究已證實他汀類藥物可通過改良梗死后心肌局部微環(huán)境提高MSCs移植療效,但他汀類藥物是否對MSCs自身發(fā)揮保護作用尚不明確。JAK激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Januskinase-signal transducers and act

7、ivators of transcription,JAK-STAT)信號通路是細胞因子信號傳導(dǎo)的重要途徑,廣泛參與多種細胞的生理病理過程。本研究擬采用體外缺氧/無血清(Hypoxia/Serum-deprivation,H/SD)培養(yǎng)條件模擬梗死后微環(huán)境并誘導(dǎo)大鼠骨髓MSCs凋亡模型,探討瑞舒伐他汀(rosuvastatin,Rosu)對MSCs的保護作用,并深入研究JAK-STAT信號通路在其中的作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)條

8、件下,大鼠骨髓MSCs分常氧對照組、H/SD對照組、不同濃度梯度(0.001μM-10μM)Rosu處理組、JAK2阻斷劑AG490(1μM)處理組以及Rosu(1μM)加AG490(1μM)聯(lián)合處理組。流式細胞儀檢測各組MSCs的凋亡比例,Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2水平及JAK2、STAT3、eNOS蛋白表達及磷酸化水平。
　　 結(jié)果:流式細胞儀分析顯示,與常氧組比較,H/SD組MSCs早期凋

9、亡率顯著升高(44.49±3.43％vs.4.55±1.98％,P=0.000)。0.01-10μM Rosu處理組MSCs早期凋亡率(25.45±5.72％、18.47±4.31％、17.62±3.6％、24.99±3.85％)均顯著低于H/SD組(P均<0.01),不同濃度梯度間相比無顯著性差異(P均>0.05)。而0.001μM Rosu處理組MSCs早期凋亡率(43.07±6.56％,P>0.05)與H/SD組相比無顯著性差異。

10、與H/SD組相比,單純1μM AG490處理對MSCs早期凋亡率無顯著影響(37.7±4.08％vs.44.49±3.43％,P>0.05),而1μM Rosu加用1μMAG490后細胞早期凋亡率高于單純Rosu組(34.81±4.08％vs.17.62±3.6％,P=0.000),但低于H/SD組(34.81±4.08％vs.44.49±3.43％,P<0.01)。
　　 Western Bbt結(jié)果顯示,H/SD組Bax、Bc

11、l-2水平較常氧對照組顯著升高(P<0.05)；與H/SD組Bax水平比較,0.1μM與1μM Rosu處理組顯著低于H/SD組(P<0.05),其余Rosu濃度組無顯著差異(P>0.05)；與H/SD組Bcl-2水平比較,0.01μM-10μM Rosu組均顯著增加(P均<0.01)。與單純1μM Rosu相比,Rosu加用AG490后Bcl-2表達水平降低(P<0.05),而Bax表達水平增加(P<0.01)。
　　 與H/

12、SD組比較,0.01-10μM Rosu處理組JAK2、STAT3磷酸化水平明顯升高(P<0.01)；eNOS磷酸化水平在0.001μM(P<0.05)和10μM(P<0.01)Rosu組顯著增高。與單純1μM Rosu組相比,1μM Rosu加入AG490后可顯著抑制JAK2、STAT3及eNOS蛋白的磷酸化水平。
　　 結(jié)論:1.Rosu可抑制缺氧無血清培養(yǎng)條件誘導(dǎo)的MSCs凋亡,從而提高其存活率；2.JAK2-STAT3-

13、eNOS信號通路介導(dǎo)了Rosu對MSCs的保護作用。
　　 目的:急性心肌梗死后心肌局部微環(huán)境惡劣,移植到體內(nèi)的干細胞存活率低,進而限制了干細胞移植的治療效果。我們既往的研究初步表明,圍梗死期給予小劑量他汀類藥物能夠減輕梗死心肌局部的炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡損傷,提高移植的骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)存活,并改善心功能。然而,他汀類藥物改良梗死心肌局部微環(huán)境的具體機制仍不明確。
　

14、　 方法:將200只雌性SD大鼠隨機分為5組(n=40):對照組(control)；瑞舒伐他汀組(R組)；MSCs移植組(M組);瑞舒伐他汀與MSCs移植聯(lián)合組(M+R組)；以及瑞舒伐他汀+MSCs移植+JAK2抑制劑AG490處理組(M+R+AG組)。采用結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法制作急性心肌梗死模型,梗死后1周在梗死中央?yún)^(qū)及梗死周邊區(qū)心肌內(nèi)多點注射MSCs(2×106 cells),對照組動物注射等體積培養(yǎng)液。在梗死后1周(基線)及

15、MSCs移植后4周(終點)分別行心臟超聲檢測。MSCs移植后4周處死動物,取心臟組織,分別行病理組織學(xué)及分子生物學(xué)檢測。
　　 結(jié)果:MSCs移植后4周,心臟超聲顯示,與對照組相比,左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)僅在M+R組顯著減小(P<0.001),而在R組、M組及M+R+AG組均無顯著差異(P均>0.05)；左室射血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)在M組(P<0.05)及M+R組(

16、P<0.001)均顯著增加,且增加程度在M+R組也顯著高于M組(P<0.001)。
　　 心肌組織Masson's Trichrome染色顯示,各組均有左室心肌透壁性梗死。與對照組相比,僅M+R組左室纖維化面積明顯減小(8.4％±1.8％vs.18.3％±2.8％,P<0.001)；而R組(17.7％±2.1％,P>0.05)、M組(16.1％±2.0％,P>0.05)及M+R+AG組(16.5％±1.9％,P>0.05)均無顯

17、著差異。與其他各組相比,M+R組存活心肌比例增多,梗死周邊區(qū)細胞外基質(zhì)聚集及纖維化減少。
　　 以Real-Time PCR定量檢測MSCs移植各組心肌組織中SRY基因水平,評價干細胞存活率。結(jié)果顯示,盡管各組移植干細胞存活率均較低,而在M+R組(8.90％±0.74％)明顯高于M組(2.31％±0.20％,P<0.001)及M+R+AG組(3.89%±0.33％,P<0.001)。
　　 與對照組相比,梗死交界區(qū)毛細血

18、管密度在M+R組顯著升高(21.72±1.40 vs8.54±0.61,P<0.005),而在R組(13.90±1.01)及M組(9.28±0.80)均無顯著差異(P均>0.05)；且M+R組均顯著高于R組、M組及M+R+AG組(9.57±0.82,P均<0.005)。與對照組相比,梗死中央?yún)^(qū)毛細血管密度在M+R組亦顯著升高(19.40±1.12 vs.5.20±0.51,P<0.005),而在R組(11.13±0.9)及M組(7.22

19、±0.63)均無顯著差異(P均>0.05),而M+R組顯著高于R組、M組及M+R+AG組(6.20±0.45,P均<0.05)。
　　 免疫組織熒光染色顯示,部分移植的MSCs表達心肌肌鈣蛋白Ⅰ,且MSCs分化效率在M+R組顯著高于M組以及M+R+AG組。
　　 Western Blot結(jié)果顯示,對照組及各治療組均顯示心肌內(nèi)JAK2及STAT3蛋白激活。與對照組相比,p-JAK2、p—STAT1及p-STAT3水平在R組

20、及M+R組顯著升高(P均<0.001),而在M組無顯著差異(P>0.05)；與M+R組比較,p-JAK、p—STAT1及p-STAT3水平在M+R+AG組顯著降低(P<0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.瑞舒伐他汀聯(lián)合MSCs移植能夠明顯增強MSCs的移植療效,減輕梗死后炎癥及纖維化,促進MSCs向心肌細胞分化效率及新生血管生成作用,改善心臟功能,并抑制心肌梗死后左室重塑。
　　 2.瑞舒伐他汀通過激活JAK