骨髓干細胞誘導分化的肝細胞移植對大鼠肝切除術(shù)后肝衰治療作用的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：原位肝移植(OLT)是目前治療急性肝功能衰竭、終末期肝病和代謝性肝病最有效的方法，但由于供肝缺乏等原因在臨床廣泛開展仍有一定的困難。肝細胞移植(HCT)與原位肝移植比較，具有價廉、操作簡單、可重復進行、移植細胞可以體外培養(yǎng)增殖及冷凍保存，還可以進行基因修飾等優(yōu)點。研究發(fā)現(xiàn)HCT可以糾正先天性肝臟代謝缺陷、輔助肝功能支持和替代受損肝實質(zhì)。隨著HCT在理論與技術(shù)方面不斷發(fā)展，已逐漸呈現(xiàn)出替代OLT治療肝病的潛力，當前肝細胞來

2、源短缺、肝細胞移植后增殖能力差及免疫排斥等問題是限制HCT發(fā)展的主要原因。 骨髓干細胞(BMSC)可以橫向分化為肝前體細胞和肝細胞，并具有取材容易；增殖能力強；體外培養(yǎng)、傳代及擴增容易；可以直接取材于患者本人，能避免移植后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生等特點。用BMSC替代成熟肝細胞進行移植治療肝病，有望使細胞移植在肝病治療方面取得重大突破。 BMSC可以通過兩種方式對肝臟進行修復，一是直接進行BMSC移植，然后BMSC在體內(nèi)分化為

3、肝細胞并增殖，從而使肝臟得以修復；二是體外誘導BMSC定向分化為肝細胞或肝前體細胞并傳代擴增后再進行移植。目前的研究大都直接進行BMSC移植，關(guān)于移植骨髓干細胞體外誘導分化的肝細胞治療急性肝衰的研究國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。 本實驗主要研究目的：探討骨髓干細胞誘導分化的肝細胞移植對肝切除術(shù)后肝衰大鼠的治療作用。 研究方法： 1、復蘇大鼠骨髓干細胞誘導分化的肝細胞及檢測其功能3復蘇冷凍保存的由大鼠骨髓干細胞誘導分化的肝細

4、胞，應(yīng)用苔盼藍染色測定復蘇后細胞活率，將復蘇后肝細胞培養(yǎng)24小時后測定培養(yǎng)液中ALB濃度，于移植前用BrdU標記肝細胞，用PBS液調(diào)細胞濃度為106/ml備用。 2、大鼠急性肝衰模型的建立 (1)、SD大鼠隨機分為三組，A組(切除85％肝組織)、B組(切除90％肝組織)、C組(切除95％肝組織)，觀察術(shù)后各組大鼠的一般情況、存活率、血清生化指標及肝組織病理變化，建立在我院實驗條件下的大鼠急性邊緣性肝衰模型。 (2

5、)、SD大鼠隨機分為兩組，A組腹腔注射倒千里光堿(用量為30mg/kg)，B組腹腔注射生理鹽水，注射兩次后切除大鼠肝組織70％，觀察術(shù)后各組大鼠的一般情況、存活率、血清生化指標，建立抑制了內(nèi)源性肝細胞增生的大鼠急性肝衰模型。 3、骨髓干細胞誘導分化的肝細胞移植對大鼠急性肝衰的治療作用 (1)、采用切除大鼠90％肝組織建立的急性肝衰模型，分三組進行治療實驗，A組于脾包膜下移植入骨髓干細胞在體外誘導分化的肝細胞2～4×106

6、個、B組于脾包膜下移植入骨髓干細胞2～4×106個、C組于脾包膜下移植入PBS液，觀察術(shù)后大鼠的存活率、血清生化指標及受體大鼠肝組織內(nèi)移植細胞情況。 (2)、采用抑制了內(nèi)源性肝細胞增生的大鼠急性肝衰模型，分兩組進行治療實驗，A組于脾包膜下移植入骨髓干細胞在體外誘導分化的肝細胞2～4×106個、B組于脾包膜下移植入PBS液，觀察術(shù)后大鼠的存活率、血清生化指標及受體大鼠肝組織內(nèi)移植細胞情況。 研究結(jié)論： 1、復蘇冷凍

7、保存的大鼠骨髓干細胞在體外經(jīng)誘導分化的肝細胞具有較高的活率，并保持有肝細胞的特征，可用于細胞移植。 2、90％肝切除誘導的肝衰是一個理想的大鼠急性邊緣性肝衰模型，術(shù)后3天內(nèi)為觀察肝衰情況的窗口期。應(yīng)用腹腔注射倒千里光堿+70％肝切除可建立抑制了內(nèi)源性肝細胞增生的大鼠急性肝衰模型。 3、大鼠骨髓干細胞在體外經(jīng)誘導分化的肝細胞脾內(nèi)移植可明顯改善急性邊緣性肝衰大鼠的存活率，部分改善肝功能，移植肝細胞可在受體肝組織中存活并發(fā)揮肝