骨髓間充質干細胞移植對大鼠急性肝功能衰竭治療作用的實驗研究.pdf

1、研究背景 干細胞是指一類具有自我增殖能力和分化潛能的細胞，在特定的條件下可以分化為不同的功能細胞，甚至形成多種組織和器官。因此，干細胞的研究己成為生命科學的一個重要領域。業(yè)已證實，成年個體骨髓內存在具有多向分化特性的干細胞，在體內和體外不同的微環(huán)境下，這些多潛能干細胞可以分化成三個胚層來源的細胞和組織結構如皮膚和神經細胞，肝細胞和胰腺細胞、骨細胞和軟骨細胞、脂肪細胞和肌細胞及內皮細胞等，顯示了成體骨髓多功能干細胞極高的可塑性。這

2、對于各種先天性疾病、老年性疾病和各種原因所致的組織缺損具有重要的應用前景。 目前備受關注的干細胞主要有胚胎干細胞，神經干細胞，造血干細胞和骨髓間充質干細胞等。胚胎干細胞由于其無與倫比的增殖能力和分化潛能而成為干細胞研究較為理想的模型，但由于存在論理學的問題胚胎干細胞的研究仍然受到限制。相對間充質干細胞的研究卻日益顯示了其強大的生命力，這主要表現在以下幾個方面：(1)首先間充質干細胞從增殖能力和分化潛能上具備干細胞最基本的特點，其

3、分化潛能不僅僅局限于中胚層組織，而且在特定的條件下可以向內胚層和外胚層的組織細胞分化；(2)成年個體一生中均具備間充質干細胞庫，這也可能是成年個體組織更新和組織修復的必備前提，而且由于成體干細胞在定向分化進行組織修復中不存在主要組織相容性復合物的限制的特性，使得成體干細胞在治療上的前景更加廣闊；(3)骨髓間充質干細胞的取材和分離非常容易，培養(yǎng)條件相對成熟，已經可以在體外大量擴增。 急性肝衰竭仍是一種死亡率較高的疾病，肝移植是治療

4、這種疾病的一種有效方法。但肝移植存在許多問題，如：供體缺乏、手術創(chuàng)傷大、排異、費用昂貴等。所以，迫切需要其他可以選擇的治療急性肝衰竭的方法。肝細胞移植可作為肝臟移植的一種替代方法，但同樣存在著供體來源受限問題，同時肝細胞的獲取具有很大的創(chuàng)傷性。干細胞的研究為解決這個問題提供了新的希望。骨髓間充質干細胞具有極強的多向分化潛能，國內外許多研究已證明其在體內、體外可分化為肝細胞。同時骨髓間充質干細胞的來源充足，易于獲得，作為組織干細胞的一種，

5、增殖能力強，體外能大量擴增，能滿足細胞移植要輸入大量功能細胞的要求。病人可使用自體骨髓移植，完全克服免疫排斥，從根本上解決器官移植面臨的免疫排斥問題。 Jang YY等發(fā)現，當造血干細胞與受損的肝細胞共同培養(yǎng)時，造血干細胞在7個小時內就可轉化為肝細胞。Makowka L等報道腹腔內移植骨髓干細胞可提高D-半乳糖胺誘導的急性肝衰竭大鼠的生存率。LiuZC等將微囊化骨髓干細胞移植于90﹪肝切除誘導的急性肝衰竭大鼠腹腔內，發(fā)現微囊內的骨髓干細

6、胞可在腹腔內轉化為肝細胞樣細胞，并提高急性肝衰竭大鼠的生存率。這些研究說明，骨髓干細胞可用來治療急性肝衰竭。但目前尚未見肝臟內移植骨髓干細胞治療急性肝衰竭的報道。骨髓干細胞包含造血干細胞及骨髓間充質干細胞，單獨骨髓間充質干細胞移植是否亦有助于治療急性肝衰竭亦未見相關報道。因此我們設計此課題觀察骨髓間充質干細胞門靜脈移植是否能夠治療大鼠急性肝衰竭。 目的: (1)探索從大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)骨髓間充質干細胞的方法，建立穩(wěn)定的

7、大鼠骨髓間充質干細胞系，為后續(xù)的干細胞研究提供穩(wěn)定的細胞模型(2)建立大鼠肝切除急性肝衰竭模型，將體外培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞大鼠肝內移植，探討骨髓間充質干細胞移植是否有助于急性肝衰竭的治療及可能的治療機制。 方法 (1)利用Percoll密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離有核細胞，在15﹪胎牛血清，表皮生長因子，白細胞抑制因子和血小板衍生生長因子的作用下用DMEM/F-12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，獲得大鼠骨髓間充質干細胞。繪制細胞生

8、長曲線，以Patterson公式計算細胞在對數生長期的倍增時間。用TRAP--銀染法檢測該細胞系的端粒酶活性，流式細胞術測定該細胞系在反復傳代后細胞的表型的穩(wěn)定狀況。 (2)以BrdU標記骨髓間充質干細胞。建立90﹪肝切除誘導的急性肝衰竭模型，F-344大鼠隨機分為二組，A組(實驗組)：90﹪肝切除后經門靜脈移植0.5ml骨髓間充質干細胞懸液(含有1×10<'6>個細胞)；B組(對照組)：90﹪肝切除后經門靜脈移植0.5ml生理鹽水。觀

9、察術后二組大鼠的一般情況、血清生化指標及生存率，并取實驗組肝組織制備切片，通過免疫組化、免疫熒光雙標記技術觀察受體大鼠肝組織內移植細胞情況。 結果: (1)剛剛開始貼壁生長的骨髓間充質干細胞呈規(guī)整的燕麥形，形態(tài)規(guī)整?？寺⌒纬珊髮瞪L期大鼠骨髓間充質干細胞呈梭形或長多邊形，形態(tài)不完全均一，但細胞排列整齊，邊界清晰，在培養(yǎng)瓶中分布及生長均勻。繪制細胞生長曲線，Patterson公式計算骨髓間充質干細胞的倍增時間為18hr。

10、TRAP-銀染法測定骨髓間充質干細胞端粒酶活性，顯示大鼠骨髓間充質干細胞的端粒酶為陽性，表達強度與腫瘤細胞(SKOV3)一致。流式細胞術測定骨髓間充質干細胞的DNA含量和細胞周期，分析結果并與腫瘤細胞SKOV3進行比較?？梢姽撬栝g充質干細胞100﹪為二倍體，S期細胞數量較多(34.72﹪)，而腫瘤細胞有較高的異倍體率，二倍體細胞僅為41.97﹪，而且S期細胞顯著減少(12.1﹪/34.7﹪)。流式細胞術細胞表型的鑒定分析顯示骨髓間充質干

11、細胞表達CD44、CD90，而CD34、CD45、MHC Ⅰ、MHCⅡ為陰性。 (2)BrdU標記的骨髓間充質干細胞細胞染色后可見細胞核內有棕褐色陽性反應物。臺盼藍染色測定BrdU標記后細胞活率，可見標記后細胞活率95﹪±0.6﹪。90﹪肝切除后，大鼠于術后2-4小時內蘇醒，然后逐漸進入肝功能衰竭狀態(tài)，表現為拒食，活動明顯減少，毛蓬松。精神萎靡、嗜睡或昏睡，對外界刺激反應遲鈍，尿失禁，尿色深黃。大部分大鼠于術后3日內死亡，7天存

12、活率僅為20﹪。術后大鼠血清丙氨酸轉氨酶及天冬氨酸轉氨酶水平迅速升高，并于術后第一天達到峰值，之后逐漸下降，術后1、2、3、5天血清丙氨酸轉氨酶及天冬氨酸轉氨酶值明顯高于術前(P<0.05)。術后第7天時丙氨酸轉氨酶及天冬氨酸轉氨酶值仍高于術前，但無統(tǒng)計學差異。ALB水平于術后開始下降，第2天時達到最低水平，于第3天開始上升，術后1、2、3、5天血清白蛋白值明顯低于術前值(P<0.05)。術后第7天時白蛋白值雖仍高于術前，但統(tǒng)計學上無顯

13、著性差異。肝衰竭大鼠經門靜脈移植骨髓間充質干細胞后發(fā)現：實驗組大鼠術后7天存活率為70﹪，對照組大鼠術后7天存活率為20﹪，實驗組大鼠存活率明顯高于對照組(p<0.05)。術后兩組大鼠丙氨酸轉氨酶及天冬氨酸轉氨酶水平均升高，白蛋白水平降低。術后3、5天時實驗組各項指標較對照組有所改善，其中丙氨酸轉氨酶及天冬氨酸轉氨酶改善明顯，兩組數據比較差異有顯著性(P<0.05)，白蛋白在數值上雖有改變，但兩組數據在統(tǒng)計學上無顯著性差異(P>0.05

14、)。術后第7天時兩組各項生化指標均接近正常范圍，兩組間數據比較無顯著性差異(P>0.05)。免疫組織化學染色觀察結果顯示BrdU標記的骨髓間充質干細胞移植后可在肝組織中出現，多分布在匯管區(qū)周圍，細胞核染成棕褐色，細胞表現肝細胞形態(tài)。免疫熒光雙染色，大鼠肝組織切片中見BrdU標記細胞為綠色熒光，白蛋白為紅色熒光，綠色熒光與紅色熒光疊合后呈黃色。黃色細胞來源于BrdU標記并有白蛋白表達的細胞。 結論: (1)利用Percol

15、l密度梯度離心法分離F-344大鼠骨髓有核細胞，在1.5﹪FCS、EGF、LIF和PDGF的作用下，用：DMEM-LG/F-12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可獲得穩(wěn)定生長的大鼠MSCs。培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞系性狀穩(wěn)定，表型穩(wěn)定均一，是理想的大鼠骨髓間充質干細胞系，可用于進一步的組織工程、細胞和分子生物學研究。 (2)骨髓間充質干細胞經門靜脈移植于急性肝衰竭大鼠體內，改善了受損肝臟的功能，顯著提高了急性肝衰竭大鼠的生存率；骨髓間充質干細胞可