版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、目的: 建立針對(duì)以血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-β(platelet-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)為靶標(biāo)的特異及靈敏的細(xì)胞模型體系,用于酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase,RTK)抑制劑的篩選和研究。 方法:
2、 1、pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2真核表達(dá)載體的構(gòu)建:利用TRIZOL提取人胚肝二倍體細(xì)胞(CCC-HEL)的總RNA,運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增目的片段PDGFR-β和VEGFR-2。分別將其定向插入pcDNA3.1表達(dá)載體的限制性酶切位點(diǎn)KpnⅠ和XbaⅠ之間,構(gòu)建pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2。分別利用PCR初步鑒定重組表達(dá)載體pcDNA3.1-PDGF
3、R-β和pcDNA3.1-VEGFR-2,再經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2,最后測(cè)序進(jìn)一步鑒定pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2序列的準(zhǔn)確性。 2、NIH3T3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立和鑒定:把重組表達(dá)載體pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2采用磷酸鈣共沉淀法分別轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞株,利用G418的藥物
4、選擇特性,對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行壓力篩選,并對(duì)其進(jìn)行RT-PCR鑒定,最后運(yùn)用Western blot檢測(cè)目的基因蛋白表達(dá)情況。 3、NIH3T3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株功能學(xué)的鑒定:采用MTT法在穩(wěn)定表達(dá)PDGFR-β或VEGFR-2的NIH3T3細(xì)胞株對(duì)其配體和時(shí)間依賴性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示NIH3T3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株獲得了PDGF/VEGF因子依賴性增殖/存活特征。 4、HeLa瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立和鑒定:把重組表達(dá)載體pcDNA3.1-P
5、DGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2采用FuGENE6試劑分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株,運(yùn)用RT-PCR和Western blot檢測(cè)PDGFR-β/VEGFR-2.的基因和蛋白表達(dá)情況。 5、細(xì)胞模型的應(yīng)用: (1)高通量酪氨酸激酶抑制劑細(xì)胞篩選平臺(tái)的建立及應(yīng)用分別在穩(wěn)定表達(dá)PDGFR-β/VEGFR-2的NIH3T3細(xì)胞株及HUVCE細(xì)胞株(天然表達(dá)VEGFR-2)上,應(yīng)用MTT檢測(cè)方法,對(duì)候選的化合物進(jìn)行了PD
6、GF/VEGF依賴性細(xì)胞增殖抑制作用的篩選。 (2)PDGFR-β和VEGFR-2磷酸化分析平臺(tái)的建立及應(yīng)用對(duì)篩選出具有PDGF/VEGF依賴性細(xì)胞增殖抑制作用的先導(dǎo)化合物在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PDGFR-β/VEGFR-2的HeLa細(xì)胞株上,應(yīng)用Western blot檢測(cè)手段,觀察先導(dǎo)化合物對(duì)PDGF/VEGF依賴性受體磷酸化的抑制作用。在HUVCE細(xì)胞株上,應(yīng)用免疫沉淀和Western blot檢測(cè)手段,觀察先導(dǎo)化合物對(duì)VEGF依賴性
7、受體磷酸化的抑制作用。 6、統(tǒng)計(jì)采用SPSS12.0分析軟件進(jìn)行分析,具體采用卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行分析,當(dāng)P<0.05,認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、真核表達(dá)載體pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2經(jīng)測(cè)序其目的片段與理論預(yù)計(jì)一致。 2、對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞株和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株行RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果分別證實(shí)目的
8、基因整合入細(xì)胞基因組,且顯著表達(dá)PDGFR-β/VEGFR-2蛋白。 3、在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞株上,進(jìn)行配體和時(shí)間依賴性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示它們具有PDGF或VEGF因子依賴性增殖/存活特征。 4、經(jīng)PDGF和VEGF依賴性細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的篩選具有針對(duì)PDGF和/或VEGF先導(dǎo)化合物,進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行受體磷酸化抑制作用的測(cè)定結(jié)果顯示:它們具有對(duì)PDGFR-β和/或VEGFR-2磷酸化的顯著抑制作用。 結(jié)論:
9、 1、通過(guò)分子克隆、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法分別成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PDGFR-β或VEGFR-2的NIH3T3細(xì)胞株,并在此基礎(chǔ)上成功建立酩氨酸激酶抑制劑的高通量細(xì)胞篩選平臺(tái)(High throughput screening,HTS)。 2、通過(guò)分子克隆、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法分別成功構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)PDGFR-β或VEGFR-2的HeLa細(xì)胞株。也在此基礎(chǔ)上成功建立酪氨酸激酶抑制劑的受體磷酸化分析平臺(tái)。 3、在HUVCE細(xì)胞株上,成功構(gòu)建V
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 小分子脾酪氨酸激酶(Syk)抑制劑篩選的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 酪氨酸激酶抑制劑對(duì)T細(xì)胞功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- IGF1R酪氨酸激酶細(xì)胞模型構(gòu)建及藥物篩選的應(yīng)用.pdf
- 新型蛋白酪氨酸激酶抑制劑的設(shè)計(jì)與合成.pdf
- 酪氨酸激酶抑制劑篩選方法的建立及姜黃素衍生物的篩選.pdf
- 酪氨酸激酶抑制劑拉帕替尼的合成.pdf
- 人表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的克隆表達(dá)和酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建.pdf
- 抗腫瘤蛋白酪氨酸激酶抑制劑的設(shè)計(jì)與合成.pdf
- 酪氨酸激酶抑制劑對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖及黏附誘導(dǎo)耐藥的影響.pdf
- EGFR酪氨酸激酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及生物活性篩選和類藥性化合物庫(kù)的構(gòu)建.pdf
- 酪氨酸激酶抑制劑在慢性粒細(xì)胞性白血病治療中的應(yīng)用效果.pdf
- 酪氨酸激酶小分子抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究.pdf
- 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制劑篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf
- 新型受體酪氨酸激酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成與活性評(píng)價(jià).pdf
- 受體酪氨酸激酶抑制劑在軟骨修復(fù)中的作用研究.pdf
- 酪氨酸激酶抑制劑AW1的合成及其藥理學(xué)活性.pdf
- 酪氨酸激酶抑制劑對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2樣極化的影響.pdf
- 新型蛋白酪氨酸激酶抑制劑(ZHT系列化合物)的研究.pdf
- 酪氨酸激酶抑制劑2,5-MC預(yù)防血管再狹窄的研究.pdf
- 雜環(huán)VEGFR-2酪氨酸激酶抑制劑的合成及生物活性研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論