酪氨酸激酶抑制劑細(xì)胞篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、目的： 建立針對(duì)以血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-β（platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）為靶標(biāo)的特異及靈敏的細(xì)胞模型體系，用于酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTK）抑制劑的篩選和研究。 方法：

2、 1、pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2真核表達(dá)載體的構(gòu)建：利用TRIZOL提取人胚肝二倍體細(xì)胞（CCC-HEL）的總RNA，運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增目的片段PDGFR-β和VEGFR-2。分別將其定向插入pcDNA3.1表達(dá)載體的限制性酶切位點(diǎn)KpnⅠ和XbaⅠ之間，構(gòu)建pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2。分別利用PCR初步鑒定重組表達(dá)載體pcDNA3.1-PDGF

3、R-β和pcDNA3.1-VEGFR-2，再經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2，最后測(cè)序進(jìn)一步鑒定pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2序列的準(zhǔn)確性。 2、NIH3T3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立和鑒定：把重組表達(dá)載體pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2采用磷酸鈣共沉淀法分別轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞株，利用G418的藥物

4、選擇特性，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行壓力篩選，并對(duì)其進(jìn)行RT-PCR鑒定，最后運(yùn)用Western blot檢測(cè)目的基因蛋白表達(dá)情況。 3、NIH3T3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株功能學(xué)的鑒定：采用MTT法在穩(wěn)定表達(dá)PDGFR-β或VEGFR-2的NIH3T3細(xì)胞株對(duì)其配體和時(shí)間依賴性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示NIH3T3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株獲得了PDGF/VEGF因子依賴性增殖/存活特征。 4、HeLa瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立和鑒定：把重組表達(dá)載體pcDNA3.1-P

5、DGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2采用FuGENE6試劑分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株，運(yùn)用RT-PCR和Western blot檢測(cè)PDGFR-β/VEGFR-2.的基因和蛋白表達(dá)情況。 5、細(xì)胞模型的應(yīng)用： （1）高通量酪氨酸激酶抑制劑細(xì)胞篩選平臺(tái)的建立及應(yīng)用分別在穩(wěn)定表達(dá)PDGFR-β/VEGFR-2的NIH3T3細(xì)胞株及HUVCE細(xì)胞株（天然表達(dá)VEGFR-2）上，應(yīng)用MTT檢測(cè)方法，對(duì)候選的化合物進(jìn)行了PD

6、GF/VEGF依賴性細(xì)胞增殖抑制作用的篩選。 （2）PDGFR-β和VEGFR-2磷酸化分析平臺(tái)的建立及應(yīng)用對(duì)篩選出具有PDGF/VEGF依賴性細(xì)胞增殖抑制作用的先導(dǎo)化合物在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PDGFR-β/VEGFR-2的HeLa細(xì)胞株上，應(yīng)用Western blot檢測(cè)手段，觀察先導(dǎo)化合物對(duì)PDGF/VEGF依賴性受體磷酸化的抑制作用。在HUVCE細(xì)胞株上，應(yīng)用免疫沉淀和Western blot檢測(cè)手段，觀察先導(dǎo)化合物對(duì)VEGF依賴性

7、受體磷酸化的抑制作用。 6、統(tǒng)計(jì)采用SPSS12.0分析軟件進(jìn)行分析，具體采用卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、真核表達(dá)載體pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2經(jīng)測(cè)序其目的片段與理論預(yù)計(jì)一致。 2、對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞株和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株行RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果分別證實(shí)目的

8、基因整合入細(xì)胞基因組，且顯著表達(dá)PDGFR-β/VEGFR-2蛋白。 3、在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞株上，進(jìn)行配體和時(shí)間依賴性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示它們具有PDGF或VEGF因子依賴性增殖/存活特征。 4、經(jīng)PDGF和VEGF依賴性細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的篩選具有針對(duì)PDGF和/或VEGF先導(dǎo)化合物，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行受體磷酸化抑制作用的測(cè)定結(jié)果顯示：它們具有對(duì)PDGFR-β和/或VEGFR-2磷酸化的顯著抑制作用。 結(jié)論：

9、 1、通過(guò)分子克隆、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法分別成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PDGFR-β或VEGFR-2的NIH3T3細(xì)胞株，并在此基礎(chǔ)上成功建立酩氨酸激酶抑制劑的高通量細(xì)胞篩選平臺(tái)（High throughput screening，HTS）。 2、通過(guò)分子克隆、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法分別成功構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)PDGFR-β或VEGFR-2的HeLa細(xì)胞株。也在此基礎(chǔ)上成功建立酪氨酸激酶抑制劑的受體磷酸化分析平臺(tái)。 3、在HUVCE細(xì)胞株上，成功構(gòu)建V