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1、 以農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接轉(zhuǎn)化植物的BIBAC載體的發(fā)展,加速了植物基因組研究,基因圖位克隆和基因的功能分析。生物體的許多重要性狀牽涉到復(fù)雜的生理生化反應(yīng),是受多基因或基因簇的控制,而且植物在同一信號(hào)途徑上實(shí)現(xiàn)其抗鹽機(jī)制相關(guān)的基因可能成簇存在?;谶@一假設(shè),構(gòu)建了鹽生植物小鹽芥(Thellungiellahalophila)大片段DNA的基因組文庫(kù):BIBAC文庫(kù)。這個(gè)文庫(kù)的建成,可以實(shí)現(xiàn)成簇或者同一信號(hào)途徑上面的許多基因的同時(shí)轉(zhuǎn)化,并且為發(fā)
2、現(xiàn)與小鹽芥耐鹽相關(guān)基因提供可能?! ”狙芯客ㄟ^根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo),將帶有分子量為50-100kb的小鹽芥基因組片段插入到擬南芥(Arabidopsisthaliana)的基因組中,得到20個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗鹽分析,得到比野生型和其他的轉(zhuǎn)基因株系有更好的耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因植株BAC256。在此基礎(chǔ)上,對(duì)該產(chǎn)生抗鹽植株的小鹽芥DNA大片段進(jìn)行亞克隆分析,以確定其中的耐鹽基因。在亞克隆分析過程中,首先使用有六個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)
3、切酶BamHI把BAC256中的插入片段完全酶切成5個(gè)較大的片段,并與植物載體pCAMBIA1300構(gòu)建亞克??;與此同時(shí),為了避免由于用BamHI酶切時(shí),可能破壞插入片段中的耐鹽基因,用只有四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切BAC256,選取一定大小范圍(4-6kb)的部分酶切片斷,將其與植物載體pCAMBIA1300構(gòu)建小片段亞克隆。通過轉(zhuǎn)化有足夠的覆蓋倍數(shù)的亞克隆,便可以把由于BamHI的酶切可能造成的耐鹽基因破壞這一問
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