小鹽芥BIBAC文庫(kù)中抗鹽克隆的篩選及其亞克隆分析.pdf

1、　　以農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接轉(zhuǎn)化植物的BIBAC載體的發(fā)展，加速了植物基因組研究，基因圖位克隆和基因的功能分析。生物體的許多重要性狀牽涉到復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，是受多基因或基因簇的控制，而且植物在同一信號(hào)途徑上實(shí)現(xiàn)其抗鹽機(jī)制相關(guān)的基因可能成簇存在?；谶@一假設(shè)，構(gòu)建了鹽生植物小鹽芥(Thellungiellahalophila)大片段DNA的基因組文庫(kù)：BIBAC文庫(kù)。這個(gè)文庫(kù)的建成，可以實(shí)現(xiàn)成簇或者同一信號(hào)途徑上面的許多基因的同時(shí)轉(zhuǎn)化，并且為發(fā)

2、現(xiàn)與小鹽芥耐鹽相關(guān)基因提供可能?！　”狙芯客ㄟ^根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將帶有分子量為50-100kb的小鹽芥基因組片段插入到擬南芥(Arabidopsisthaliana)的基因組中，得到20個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗鹽分析，得到比野生型和其他的轉(zhuǎn)基因株系有更好的耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因植株BAC256。在此基礎(chǔ)上，對(duì)該產(chǎn)生抗鹽植株的小鹽芥DNA大片段進(jìn)行亞克隆分析，以確定其中的耐鹽基因。在亞克隆分析過程中，首先使用有六個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)

3、切酶BamHI把BAC256中的插入片段完全酶切成5個(gè)較大的片段，并與植物載體pCAMBIA1300構(gòu)建亞克??；與此同時(shí)，為了避免由于用BamHI酶切時(shí)，可能破壞插入片段中的耐鹽基因，用只有四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切BAC256，選取一定大小范圍(4-6kb)的部分酶切片斷，將其與植物載體pCAMBIA1300構(gòu)建小片段亞克隆。通過轉(zhuǎn)化有足夠的覆蓋倍數(shù)的亞克隆，便可以把由于BamHI的酶切可能造成的耐鹽基因破壞這一問