杜氏鹽藻cDNA文庫的構(gòu)建與KCBP基因的克隆及功能分析.pdf

1、近年來，隨著對萊茵衣藻等研究的廣泛開展，運用藻類基因工程的手段可以構(gòu)建高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的藻類新品種，還可以生產(chǎn)燃料、降解污染物以及構(gòu)建藻類表達系統(tǒng)生產(chǎn)大量廉價的蛋白和藥物來研究并治療人類疾病。作為單細胞生物的杜氏鹽藻具有無細胞壁、培養(yǎng)簡單等許多獨特優(yōu)點，使它不但可以作為一種新型的轉(zhuǎn)基因宿主，而且可以作為模式生物研究基因的表達調(diào)控等，因而亟待克隆杜氏鹽藻的相關(guān)功能基因的數(shù)量不斷增加，構(gòu)建杜氏鹽藻cDNA文庫顯得尤為必要。
　　纖毛和

2、鞭毛二者是可以相互指代的，都是由軸絲微管及外面包被的纖毛膜組成。已有研究表明疾病的發(fā)生與纖毛體突變存在著必然的聯(lián)系，如多囊腎等。然而本實驗室著力于將杜氏鹽藻鞭毛作為模式細胞器來研究纖毛與疾病的關(guān)系。驅(qū)動蛋白(Kinesin)和類驅(qū)動蛋白(KLPs)蛋白組成了基于微管馬達的一個大的家族，是真核細胞中一類保守的具有ATPase活性的微管馬達蛋白。這些馬達在很多基本的細胞發(fā)育進程中起著重要的作用。迄今為止，很多驅(qū)動蛋白及類驅(qū)動蛋白在包括擬南芥

3、在內(nèi)的植物中被鑒定。類驅(qū)動蛋白鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(KCBP)是在驅(qū)動蛋白和類驅(qū)動蛋白中唯一的一個在鄰近它的馬達結(jié)構(gòu)域處有一個鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，其屬于驅(qū)動蛋白-14家族的一個成員。KCBP是一個負指向的C-末端微管馬達蛋白，有三個獨立的結(jié)構(gòu)域:一個肌球蛋白尾同系物區(qū)域4(MyTH4);一個類-踝蛋白結(jié)構(gòu)域(B41);一個鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。MyTH4和類-踝蛋白結(jié)構(gòu)域(B41)在其它報道過的驅(qū)動蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)。KCBP定位在維管

4、束上，包括早前期、紡錘體上和成膜體上，這表明KCBP通過捆綁微管來形成維管束。迄今為止，KCBP同系物僅僅出現(xiàn)在植物和衣藻等少數(shù)綠藻中。
　　微管是紡錘絲的成分，破壞微管結(jié)構(gòu)就是抑制紡錘體的形成。秋水仙素能夠阻止微管的形成。驅(qū)動蛋白參與微管的組裝，CrKCBP基因是一個負末端指向的驅(qū)動蛋白基因，在“貨物”從鞭毛頂端到鞭毛基體的運輸中起作用。然而，在杜氏鹽藻中KCBP基因還沒有被克隆，同時，它在鞭毛組裝中的作用至今也沒有研究。

5、>　　本研究首先構(gòu)建了杜氏鹽藻cDNA文庫，然后利用根據(jù)各物種間序列的保守性設(shè)計的簡并引物DIMQFG和CIFAYG擴增得到了杜氏鹽藻KCBP cDNA的部分序列，利用AIBion公司的RACE擴增試劑盒，進行5’上游和3’下游的擴增。同時，利用已擴增的KCBP的部分片段序列從杜氏鹽藻的cDNA文庫中也獲得了KCBP基因的全長。然后利用秋水仙素解聚微管的特點，將杜氏鹽藻細胞處理，分別在不同的時間段提取野生型和被處理的杜氏鹽藻細胞，對其進

6、行熒光PCR，來分析該KCBP基因的功能。結(jié)果構(gòu)建得到的cDNA文庫的滴定度是5.6×106 pfu/mL，重組率約90％，平均插入片段的大小為1.9 kb.，數(shù)據(jù)證明得到了一個高質(zhì)量的文庫;杜氏鹽藻基因KCBP的全長cDNA序列為4514bp，其中5'UTR為105bp，3'UTR為593bp，開放讀碼框為3816bp，該序列已經(jīng)提交NCBI的GenBank，登錄號為: GU345802。該KCBP基因功能分析表明，80分鐘后秋水仙素