化療藥物對(duì)TRAIL誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制.pdf

1、研究背景：原發(fā)于支氣管-肺的癌(簡(jiǎn)稱(chēng)肺癌)為當(dāng)前世界各地最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在多數(shù)國(guó)家都有明顯增高趨勢(shì)。在我國(guó)城市居常見(jiàn)惡性腫瘤的首位。預(yù)期到本世紀(jì)末，肺癌將占多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家和其它國(guó)家常見(jiàn)惡性腫瘤的第1、2位，每4～5個(gè)死于癌癥的病人中便有一個(gè)是肺癌。所以這是一個(gè)嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命的疾病，也是學(xué)術(shù)上受到廣泛重視的研究課題。在現(xiàn)有化療藥物中，絕大多數(shù)在抑制生長(zhǎng)或殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體內(nèi)迅速增殖的正常細(xì)胞同樣有毒害作用，尤其是骨髓造

2、血細(xì)胞與胃腸道粘膜上皮細(xì)胞，此為化療藥物提高療效的主要障礙。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL)作為T(mén)NF家族的新成員，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷具有高度特異性，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性，所以成為生物治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 研究目的：探討腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNFrelatedapoptosisinducingligand，T

3、RAIL或稱(chēng)APO-2)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及化療藥物對(duì)TRAIL抗瘤活性的影響，并初步探討其影響機(jī)制。 研究方法：1.人肺腺癌細(xì)胞株(humanlungadenocarcinomacellstrain)A549體外培養(yǎng)。測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，繪制A549細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。采用四嘩鹽(MTT)比色法測(cè)定TRAIL，化療藥物順鉑(DDP)、足葉乙甙(VPl6)、多西他賽(TXT)以及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)A549細(xì)

4、胞增殖的生長(zhǎng)抑制率(growthinhibitoryrate，GIR)，繪制生長(zhǎng)抑制率曲線(xiàn)(growthinhibitorycurve，GIC)，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。2.光學(xué)顯微鏡觀(guān)察培養(yǎng)的正常細(xì)胞形態(tài)學(xué)及TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。研究化療藥物DDP、VP16、TXT單獨(dú)及與TRAIL聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞形態(tài)的影響。通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染色，采用流式細(xì)胞技術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)C

5、M)檢測(cè)TRAIL，化療藥物DDP、VP16、TXT以及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響。3.利用半定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)正常A549細(xì)胞TRAIL功能受體—死亡受體(deathreceptor，DR)DR4、DR5基因基礎(chǔ)表達(dá)情況，以及化療藥物DDP、VP16、TXT對(duì)A549細(xì)胞DR4、DR5基因表達(dá)的影響。

6、研究結(jié)果：1.細(xì)胞倍增時(shí)間為32.1h。在4.1×104/ml～22.5×104/ml范圍內(nèi)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。接種細(xì)胞數(shù)在1.0×104/ml～3.0×105/mi范圍內(nèi)與A值呈顯著正相關(guān)，r=0.93，表明MTT實(shí)驗(yàn)適用于該細(xì)胞株藥物敏感性試驗(yàn)。MTT結(jié)果顯示，100ng/mlTRAIL僅對(duì)A549細(xì)胞抑制率為6.84±1.14％，TRAIL濃度為1600ng/ml時(shí)，TRAIL對(duì)A549細(xì)胞抑制率為26.10±4.02％，TRA

7、IL的生長(zhǎng)抑制率隨濃度增加呈遞增趨勢(shì)。但TRAIL單獨(dú)作用IC50＞1600ng/ml。化療藥物DDP、VP16、TXT對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且呈顯著的劑量依賴(lài)性，IC50值分別為44.0μg/ml、55.1μg/ml、62.1ng/ml，其中5μg/mlDDP、7.5μg/mlVP16、4ng/mlTXT單獨(dú)作用A549細(xì)胞，抑制率分別為9.11±0.69％、10.17±2.30％、14.87±5.49％。5μg/ml

8、DDP、7.5μg/mlVP16、4ng/mlTXT與100ng/mlTRAIL聯(lián)合作用A549細(xì)胞，抑制率分別為21.40±4.48％、26.10±4.02％、19.98±4.15％?；熕幬顳DP、VP16、TXT與TRAIL聯(lián)合前后對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。 2.光學(xué)顯微鏡下，100ng/mlTRAIL、5μg/mlDDP、7.5μg/mlVP16、4ng/mlTXT分別單獨(dú)作用A549細(xì)胞

9、24h，可見(jiàn)細(xì)胞增殖減低，細(xì)胞凋亡數(shù)量較對(duì)照組略有增加。100ng/mlTRAIL與5μg/mlDDP、7.5μg/mlVP16、4ng/mlTXT聯(lián)合可見(jiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)量較單藥組顯著增加。 FCM分析顯示，100ng/mlTRAIL單獨(dú)作用A549細(xì)胞24h的凋亡率為4.44％。5μg/mlDDP、7.5μg/mlVP16、4ng/mlTXT單獨(dú)作用A549細(xì)胞24h的凋亡率分別為5.51％、7.54％、12.26％。100ng/

10、mlTRAIL與5μg/mlDDP、7.5μg/mlVP16、4ng/mlTXT聯(lián)合作用A549細(xì)胞24h的凋亡率分別為22.84％、24.32％、16.84％，均大于兩者單獨(dú)作用之和。 3.半定量RT-PCR結(jié)果顯示，亞毒性劑量VP16可上調(diào)A549細(xì)胞DR4、DR5基因表達(dá)，而亞毒性劑量DDP、TXT對(duì)A549細(xì)胞DR4、DR5基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯影響。7.5μ/mlVP16處理A549細(xì)胞8h后，DR4/β-actin、DR

11、5/β-actin的比值分別為1.13±0.13、1.06±0.25。7.5μg/mlVP16處理A549細(xì)胞12h后，DR4/β-actin、DR5/β-actin的比值分別為1.18±0.20、1.02±0.02，二者與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5μg/mlDDP、4ng/mlTXT作用A549細(xì)胞4h、8h后DR4、DR5基因轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 研究結(jié)論：1.TRAI

12、L與亞毒性劑量化療藥物DDP、VP16或TXT聯(lián)用，可協(xié)同抑制人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖。2.TRAIL與亞毒性劑量化療藥物DDP、VP16或TXT聯(lián)用，可協(xié)同增強(qiáng)人肺腺癌細(xì)胞株A549凋亡。3.亞毒性劑量化療藥物VP16可上調(diào)A549細(xì)胞DR4、DR5基因表達(dá)，這可能是TRAIL與VP16協(xié)同的重要作用機(jī)制。4.亞毒性劑量DDP、TXT對(duì)A549細(xì)胞DR4、DR5基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯影響，TRAIL與DDP、TXT協(xié)同的作用機(jī)制可能與T