MGST1抑制肺腺癌細胞的凋亡及其機制研究.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率在我國及全世界均高居首位。肺腺癌是肺癌最常見的組織類型之一，發(fā)現(xiàn)時常處于晚期，預后較差。近年雖在分子機制研究上取得較大進展，但其發(fā)病機制遠未闡明。因此研究肺腺癌的致病驅(qū)動基因，探尋肺腺癌新的治療靶基因具有重大意義。研究表明，MGST1與食管癌、上皮性卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，且在轉(zhuǎn)基因小鼠肺癌中高表達，但其在肺癌中所發(fā)揮的功能和作用機制研究尚未見報道。前期研究發(fā)現(xiàn)MGST1

2、在人肺腺癌組織標本中高表達，抑制肺腺癌細胞A549中MGST1的表達后，可抑制細胞增殖活性，促進細胞凋亡的發(fā)生，但機制尚未闡明。因此，闡明MGST1促進肺腺癌凋亡的作用機制有待進一步研究，MGST1有望成為肺腺癌新候選治療靶基因。
　　目的:
　　本實驗運用慢病毒干擾肺腺癌細胞系PC-9內(nèi)源性MGST1的表達和過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞系SPC-A-1增加外源性MGST1的表達，從正反兩方面初步研究MGST1在肺腺癌細胞中發(fā)揮

3、的生物學功能，并進行機制探討，旨在獲得MGST1在肺腺癌惡性進程中發(fā)揮重要作用的可靠實驗證據(jù)，為MGST1成為肺腺癌新候選治療靶基因提供科學依據(jù)。
　　方法:
　　本實驗運用Western-blot檢測肺上皮細胞系BEAS-2B及肺腺癌細胞系SPC-A-1、H2342、A549、H1975、PC-9、XLA-07中MGST1蛋白的基石出表達水平，并選擇PC-9及SPC-A-1作為后期研究的工具細胞;
　　運用慢病毒感染

4、肺腺癌PC-9細胞，干擾內(nèi)源性MGST1的表達，Western-blot驗證干擾效果、MTS檢測增殖活性、克隆形成實驗檢測克隆形成能力、流式細胞儀檢測細胞凋亡、Western-blot檢測相關(guān)凋亡蛋白變化;
　　運用構(gòu)建重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染篩選穩(wěn)定過表達基因細胞系的方法，建立穩(wěn)定過表達MGST1的SPC-A-1細胞系，Real-time QPCR檢測MGST1mRNA的表達水平、Western-blot檢測MGST1蛋白的表達水平、MT

5、S檢測增殖活性、克隆形成實驗檢測克隆形成能力、流式細胞儀檢測H2O2誘導細胞凋亡、Western-blot檢測相關(guān)凋亡蛋白變化。
　　結(jié)果:
　　1.MGST1蛋白在肺上皮細胞系及肺腺癌細胞系中的表達情況
　　Western-blot結(jié)果顯示:MGST1蛋白在肺腺癌細胞中的表達水平均比肺上皮細胞BEAS-2B高，且以H1975、PC-9、XLA-07細胞表達相對較高，SPC-A-1、H2342、A549細胞表達相對較低

6、。根據(jù)基礎(chǔ)表達情況，后期選擇PC-9作為慢病毒干擾MGST1的細胞系，SPC-A-1作為構(gòu)建穩(wěn)定過表達MGST1的細胞系。
　　2.慢病毒干擾PC-9細胞MGST1的表達后，促進PC-9細胞凋亡
　　MGST1干擾慢病毒感染PC-9細胞后，Western-blot結(jié)果顯示:MGST1蛋白表達顯著減少，表明感染慢病毒成功發(fā)揮干擾蛋白表達的作用;
　　MTS結(jié)果顯示:干擾MGST1的表達后，PC-9細胞增殖活性受到明顯抑制

7、;
　　克隆形成實驗結(jié)果顯示:干擾MGST1的表達后，PC-9細胞克隆形成能力明顯被抑制;
　　流式細胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示:干擾MGST1的表達后，PC-9細胞凋亡顯著增加;
　　Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示:干擾PC-9細胞的MGST1表達后，凋亡蛋白caspase9、caspase3、PARP表達降低，cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、cleaved-PARP表

8、達明顯升高。
　　3.SPC-A-1細胞過表達MGST1基因后，抑制H2O2誘導SPC-A-1細胞的凋亡
　　測序鑒定MGST1過表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，Real-time QPCR和Western-blot結(jié)果驗證MGST1在穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系SPC-A-1中轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達均升高，表明穩(wěn)定過表達MGST1的SPC-A-1細胞系成功建立;
　　MTS結(jié)果顯示:穩(wěn)定過表達MGST1基因后，SPC-A-1細胞的增殖活性明顯增加;

9、r>　　克隆形成實驗結(jié)果顯示:穩(wěn)定過表達MGST1基因后，SPC-A-1細胞克隆形成能力明顯增強;
　　流式細胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示:穩(wěn)定過表達MGST1基因后，H2O2誘導的SPC-A-1細胞凋亡顯著減少;
　　Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示:穩(wěn)定過表達SPC-A-1細胞MGST1基因后，H2O2誘導的SPC-A-1細胞凋亡蛋白caspase9、caspase3、PARP表達增多，cleaved-caspa