洛伐他汀對人肺腺癌細胞A549的體外作用及其機制研究.pdf

1、目的：研究膽固醇合成抑制劑洛伐他汀(Lovastatin，LOV)對人肺腺癌細胞A549體外抗增殖和誘導凋亡作用，觀察LOV聯(lián)合順鉑(Cisplatin)對A549細胞體外作用的影響，并探討其可能的分子機制。 方法： 1.常規(guī)體外培養(yǎng)人肺腺癌細胞A549，采用四甲基偶氮唑藍(tetrzolium-based colorimetric assay，MTT)法檢測LOV不同濃度組(0、2、5、10、20、32、50、64um

2、ol/L)、不同時間組(24、48、72h)對細胞存活和生長的影響，從而選擇適當?shù)乃幬餄舛燃白饔脮r間。根據(jù)MTT結(jié)果，設(shè)置對照組及實驗組(2、5、10、20 umol/L)。流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)測定LOV對A549細胞周期分布和凋亡的影響，光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變。分別提取各組細胞總RNA，鑒定其完整性及含量，通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Reverse transcription polymerase c

3、hain reaction，RT-PCR)半定量檢測LOV處理前后A549細胞中p27、PTEN基因mRNA的表達水平。采用流式細胞儀間接免疫熒光技術(shù)半定量檢測LOV處理前后A549細胞中p27、PTEN蛋白的表達水平。 2.采用MTT比色法檢測LOV與抗癌藥物順鉑聯(lián)合應用對A549細胞的增殖抑制作用，采用金氏公式[1]分析相互作用指數(shù)(Interaction Index)，評價聯(lián)合后的作用；流式細胞儀檢測LOV聯(lián)合不同濃度順鉑

4、對細胞凋亡的影響。 結(jié)果： 1.MTT結(jié)果顯示：LOV(0、2、5、10、20、32、50、64umol/L)對A549細胞具有抑制增殖的作用。不同濃度LOV處理細胞24～72h后，與對照組相比，各處理組OD值均有不同程度的下降，差異具有顯著性(P<0.05)。且隨著LOV處理濃度的增大、作用時間的延長，OD值逐漸下降，即LOV對A549細胞的增殖抑制作用有明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關(guān)系。LOV作用A549細胞后，

5、有明顯的細胞形態(tài)學改變：未經(jīng)藥物作用的細胞呈多形性或梭形，形態(tài)飽滿，而用藥組細胞縮小，細胞核固縮，細胞突起減少，胞體折光性減弱，胞漿內(nèi)可見有顆粒。隨LOV濃度和處理時間延長，細胞可變圓脫壁，部分細胞脹大破裂。流式細胞術(shù)檢測A549細胞周期分布和凋亡顯示，0、2、5、10、20umol/L LOV作用A549細胞48h后，隨藥物濃度增大，G0/G1期細胞逐漸增多，S期和G2/M期細胞則逐漸減少。即LOV可阻滯A549細胞周期進程于G0/G

6、1期，該作用呈劑量-效應依賴關(guān)系。0、2、5、10、20umol/L LOV作用A549細胞48h后，出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，依A549細胞濃度增大而逐漸增高；最大凋亡率為34.02％。流式細胞儀間接分析PTEN、p27蛋白表達顯示：0、2、5、10、20umol/L LOV作用A549細胞48h后，PTEN和p27的熒光指數(shù)FI值均隨處理濃度增大而逐漸增大。對于每一種蛋白，比較其處理組和對照組的FI值，差異具有顯著性(P<0.05)

7、。半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示：洛伐他汀處理前A549細胞PTEN、p27基因均表達陽性。與對照組相比，經(jīng)LOV處理的A549細胞中PTEN、p27 mRNA表達明顯升高(P<0.05)。PTEN、p27在mRNA水平及蛋白表達水平均呈明顯正相關(guān)(P<0.05)。 2.MTT比色法分析LOV聯(lián)合順鉑對A549細胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示：2、5umol/L的LOV可加強順鉑對A549細胞的增殖抑制作用。金氏公式分析相互作用指數(shù)

8、顯示，不同濃度順鉑聯(lián)合2、5umol/L的LOV的q值均大于0.85。流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示，2、5umol/L LOV與不同濃度順鉑聯(lián)合作用細胞48h后，細胞凋亡百分率隨順鉑濃度增高而增大，與對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)，且與順鉑組比較差異具有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論： 1.LOV對人肺腺癌A549細胞有明顯的抑制增殖和誘導凋亡作用。 2.LOV抑制A549細胞增殖的作用呈時間-劑量

9、依賴關(guān)系。 3本實驗證明LOV可阻滯A549細胞于G0/G1期并可誘導細胞凋亡。 4一定濃度的LOV能夠在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平提高PTEN及p27表達。初步推論LOV通過上調(diào)PTEN和p27mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白的表達而發(fā)揮其抑制肺癌A549細胞增殖、誘導凋亡的作用。 5.LOV可協(xié)同順鉑對A549細胞的增殖抑制作用。 6.LOV可強化順鉑誘導A549細胞凋亡的作用，推測LOV可增加A549細胞對化療藥