體細(xì)胞核移植胚胎和皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源干細(xì)胞的相關(guān)技術(shù)研究.pdf

1、目的：⑴研究不同核移植方法對(duì)小鼠體細(xì)胞核移植效率的影響，建立一種簡(jiǎn)單有效的核移植方法。⑵探討單一和聯(lián)合化學(xué)激活方法對(duì)小鼠體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育的影響。⑶比較一步法和二步法兩種培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)小鼠體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育的影響，確立一種有效的培養(yǎng)系統(tǒng)。⑷利用微衛(wèi)星DNA技術(shù)進(jìn)行體細(xì)胞核移植囊胚的鑒定。⑸探討小鼠體細(xì)胞核移植胚胎ES細(xì)胞樣集落分離和培養(yǎng)方法，比較不同因子對(duì)建立核移植胚胎ES細(xì)胞樣集落效率的影響。⑹體外誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞重編程為多

2、能胚胎干細(xì)胞樣集落。 方法：⑴以小鼠顆粒細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的供核細(xì)胞，采用四種去核方法(盲吸法、蔗糖輔助去核法、化學(xué)去核法、熒光染色去核法)研究卵母細(xì)胞去核率的差異，并比較了胞質(zhì)內(nèi)注射法和反向核移植法應(yīng)用于小鼠體細(xì)胞核移植的效果。⑵構(gòu)建小鼠核移植胚胎。分別使用單一激活劑鈣離子載體(A23187)、乙醇(Eth)、氯化鍶(SrCl2)及聯(lián)合蛋白激酶抑制劑6-DMAP、CB激活。⑶構(gòu)建小鼠核移植胚胎。激活后，隨機(jī)分為兩組。第1組，

3、比較核移植胚胎在KSOMgAA，KSOMgAA/KSOMgAA，cleavage medium andcleavage medium/blastocyst medium中的發(fā)育情況；第2組，觀察牛黃酸對(duì)核移植胚胎發(fā)育影響。⑷提取近交系小鼠體細(xì)胞核移植囊胚、供體BALB/c小鼠、受體C57BL/6小鼠及昆明小鼠的基因組DNA，使用巢式聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)DNA片段，即D3Mit28，D11Mit258，D12Mit136及D14

4、Mit50。⑸構(gòu)建小鼠體細(xì)胞核移植胚胎。當(dāng)核移植胚胎培養(yǎng)至早期囊胚階段，移至小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，換成ES細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4～5d，分離消化ICM，重新接種。2 d后分離出ES樣細(xì)胞集落，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。⑹分別將Pou5f1，Sox2，c-Myc和Klf4真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。分離小鼠成纖維細(xì)胞，移至小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，取轉(zhuǎn)染后的上清液培養(yǎng)。3d后，加入G418，篩選克隆2～3w。 結(jié)果：⑴熒光染色法

5、的去核率(88％)顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05)；胞質(zhì)內(nèi)注射法的囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)較反向核移植高(P<0.05)。⑵10mmol/L SrCl2處理6 d可獲得較高卵裂率(68.9％)和囊胚率(7.2％)(P<0.05)，也較A23187、Eth組高(P<0.05)；聯(lián)合激活方法中，Eth+6-DMAP+CB組(69.8％和46.05±2.62)、SrCl2+CB組(71.9％和45.40±2.23)和A23187+6-DMAP+C

6、B組(62％和39.75±1.15)卵裂率和囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于未聯(lián)合組(P<0.05)。⑶核移植胚胎發(fā)育的囊胚率、孵化率和囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)一步法和兩步法培養(yǎng)體系中沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。?；撬峒尤隟SOMgAA后能有效改善早期核移植胚胎體外發(fā)育能力。⑷通過(guò)微衛(wèi)星DNA序列的擴(kuò)增，證明核移植囊胚的微衛(wèi)星DNA與供體細(xì)胞完全相同，而與受體細(xì)胞或者對(duì)照細(xì)胞無(wú)親緣關(guān)系。⑸ ES樣細(xì)胞集落具有典型的形態(tài)學(xué)特征：集落呈鳥(niǎo)巢狀，邊緣清楚，表面平滑

7、，結(jié)構(gòu)致密，隆起生長(zhǎng)，細(xì)胞之間界限不清楚；單個(gè)細(xì)胞體積小、核大。堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性。體外可分化為擬胚體，體內(nèi)可分化成上皮樣細(xì)胞、腺體和肌肉組織。⑹篩選初期大部分克隆形態(tài)學(xué)為扁平狀，僅4株克隆為ES細(xì)胞樣生長(zhǎng)，后期克隆數(shù)增長(zhǎng)至11株。ES細(xì)胞樣克隆具有島嶼狀團(tuán)狀隆起結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：⑴熒光染色去核法和胞質(zhì)內(nèi)注射法構(gòu)建體細(xì)胞核移植胚胎效率較高，可維持胚胎早期發(fā)育。⑵乙醇聯(lián)合6-DMAP、CB組合，SrCl2聯(lián)合CB組合均能較好地激活小