凝血酶對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥作用的研究.pdf

1、目的：
　　 支氣管哮喘是兒童時(shí)期的常見呼吸道疾病。支氣管哮喘會(huì)引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，給病患帶來了極大的痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。IL-6是參與哮喘發(fā)生的一種炎癥因子，在哮喘氣道炎癥中具有重要作用。近年研究證明:凝血酶是參與呼吸道炎癥的介質(zhì)，可以介導(dǎo)前炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化。本實(shí)驗(yàn)外源性給予凝血酶及凝血酶抑制劑，建立標(biāo)準(zhǔn)大鼠哮喘動(dòng)物模型。通過①ELISA法檢測(cè)各組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中凝血酶活性;②

2、HE染色觀察各組大鼠肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況;③免疫組化法檢測(cè)各組大鼠肺組織中白介素（IL-6）蛋白表達(dá)水平;④westernblot法檢測(cè)各組大鼠肺組織中核因子-κB(NuclearfactorkappaB，NF-κB)蛋白表達(dá)情況。探討凝血酶對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的影響，從而為支氣管哮喘氣道炎癥發(fā)生機(jī)制的探討提供新的思路。
　　 方法：
　　 將24只成年雌性大鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組（N組）、哮喘模型組（A組）、凝血

3、酶組（T組）、凝血酶抑制劑組（H組），每組6只。以卵蛋白(OVA)致敏并吸入激發(fā)制備大鼠哮喘模型。實(shí)驗(yàn)組（A組、T組、H組）大鼠分別于第1、8天每只大腿內(nèi)側(cè)皮下注射OVA懸液1ml(OVA10mg+氫氧化鋁200mg+0.9％生理鹽水至1ml)，同時(shí)腹腔內(nèi)注射滅活百日咳桿菌懸液1ml（約6×109個(gè)菌株）作為佐劑。第15天始使用402超聲霧化器（上海四菱醫(yī)療器械廠）向置于密閉有機(jī)玻璃容器內(nèi)的大鼠霧化吸入2％卵蛋白（現(xiàn)配）每次30分鐘，每

4、周3次，連續(xù)激發(fā)6周。每次霧化前30min，T組每只大鼠給予霧化吸入凝血酶72u、H組每只大鼠給予霧化吸入凝血酶抑制劑-水蛭素500u/kg。正常對(duì)照組所有干預(yù)均使用生理鹽水代替OVA。造模成功后，取大鼠肺組織和BALF。采用ELISA法測(cè)定BALF中凝血酶活性，HE染色觀察肺組織炎癥浸潤(rùn)情況，免疫組化方法檢測(cè)肺組織中IL-6表達(dá)，westernblot法測(cè)定各組大鼠肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　

5、1.一般情況觀察實(shí)驗(yàn)組（A組、T組、H組）大鼠表現(xiàn)為毛發(fā)失去光澤，在造模激發(fā)過程中出現(xiàn)不同程度的咳嗽、打噴嚏、呼吸急促、腹肌緊張、四肢癱軟、行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍等癥狀。正常對(duì)照組則無上述癥狀。
　　 2.凝血酶活性
　　 哮喘組BALF中凝血酶活性高于正常對(duì)照組(P＜0.05);凝血酶組BALF中凝血酶活性高于哮喘組(P＜0.05);凝血酶抑制劑組凝血酶活性低于凝血酶組(P＜0.05)。
　　 3.觀察肺組織炎癥浸

6、潤(rùn)情況
　　 HE染色顯示正常對(duì)照組氣道無炎癥浸潤(rùn)，哮喘組氣道有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，凝血酶組有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，較哮喘組明顯，凝血酶抑制劑組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較凝血酶組減輕。
　　 4.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中IL-6的表達(dá)正常對(duì)照組免疫組化顯示肺組織IL-6基本無表達(dá);哮喘組IL-6表達(dá)較正常對(duì)照組增多;凝血酶組IL-6表達(dá)最多，較哮喘組高;凝血酶抑制劑組IL-6表達(dá)較凝血酶組明顯減少。
　　 5.肺組織中NF-κB蛋

7、白表達(dá)情況
　　 采用westernblot方法對(duì)NF-κB蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示正常對(duì)照組NF-κB微弱表達(dá)，哮喘組NF-κB表達(dá)較正常對(duì)照組升高，凝血酶組NF-κB表達(dá)水平最高，凝血酶抑制劑組表達(dá)水平較凝血酶組低。
　　 結(jié)論：
　　 1.大鼠支氣管哮喘模型建立成功。
　　 2.哮喘大鼠氣道凝血酶活性升高，凝血酶可促進(jìn)哮喘大鼠氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 3.凝血酶可促進(jìn)哮喘大鼠氣道NF