抑肽酶對(duì)凝血酶致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：凝血酶(Thrombin)是一種多功能絲氨酸蛋白酶，已被證明是通過(guò)水解蛋白酶受體家族(Protease-activatedreceptorsfamily,PARs)中的成員PAR1(蛋白酶激活受體-1，Protease-activatedreceptor-1)、PAR3(蛋白酶激活受體-3，Protease-activatedreceptor-3)、PAR4(蛋白酶激活受體-4，Protease-activatedreceptor

2、-4)而參與一系列細(xì)胞間反應(yīng)特別是炎癥過(guò)程。目前在腦水腫、腦損傷機(jī)制的研究中認(rèn)為凝血酶激活有重要作用。大量報(bào)道證實(shí)，體外循環(huán)中因血液與循環(huán)回路中的人工材料表面接觸及肝素中止而導(dǎo)致凝血酶濃度增高，但凝血酶的發(fā)生是否是CPB(心肺分流術(shù)，Cardiopulmonarybypass)中導(dǎo)致肺水腫、肺損傷的機(jī)制之一，尚待研究證實(shí)。抑肽酶(Aprotinin)是一種從牛肺組織提取的天然絲氨酸蛋白酶抑制劑，因?yàn)槠渚哂袦p少出血和輸血的作用，已經(jīng)被廣泛

3、地應(yīng)用于CPB和各種復(fù)雜的外科手術(shù)中。許多臨床研究及實(shí)驗(yàn)研究證明，抑肽酶對(duì)CPB等多種因素造成的多種損傷有一定防治作用。已有體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，抑肽酶能通過(guò)抑制凝血酶對(duì)PAR1受體的水解，但抑肽酶的抗炎作用是否與此相關(guān)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)復(fù)制凝血酶誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，以觀察凝血酶誘導(dǎo)炎癥的作用。并以此模型為基礎(chǔ)，觀察抑肽酶在體對(duì)凝血酶的抑制效果，及探討其可能機(jī)制。 材料和方法 1.凝血酶誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型的建立

4、 72只SPF級(jí)雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(C組，24只)、凝血酶50U(單位，Unit)/kg處理組(T1組，24只)、凝血酶100U/kg處理組(T2組，24只)。經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉后，正常對(duì)照組經(jīng)尾靜脈按2ml/kg劑量注入NS(生理鹽水，Normalsaline)，T1、T2組經(jīng)尾靜脈注入凝血酶溶液，然后分別于處理后0.5h(小時(shí)，Hour)、2h、6h、12h共4個(gè)觀察點(diǎn)經(jīng)頸動(dòng)脈放血

5、處死動(dòng)物，每組6只動(dòng)物。動(dòng)物處死前15min(分鐘，minute)，經(jīng)尾靜脈注入1％FINa(熒光素鈉，F(xiàn)luoresceinsodium)溶液(2ml/kg)。收集C組0.5h、T1組0.5h、T1組12h共三組頸動(dòng)脈血比較Fib(血漿纖維蛋白原，F(xiàn)ibrinogen)差異；各組每點(diǎn)均收集標(biāo)本檢測(cè)BALF(支氣管肺泡灌洗液，Bronchoalveolarlavagefluid)中WBC(白細(xì)胞，Wightbloodcell)總數(shù)、PM

6、N(中性粒細(xì)胞，Polymorphonuclearleucocyte)總數(shù)、肺濕/干重比、肺微血管通透性；收集頸動(dòng)脈血分離血清以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法，Enzymelinkedimmunosorbentassay)測(cè)定檢查VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，Vascularendothelialgrowthfactor)、TNF-α(腫瘤壞死因子-α，Tumornecrosisfactor-α)濃度；取右肺上葉組織切片，光鏡下觀察肺組織病理

7、形態(tài)的改變，IHC法(免疫組織化學(xué)法，Immunohistochemistry)檢測(cè)VEGF、TNF-α在組織中的表達(dá)；并觀察動(dòng)物一般情況。 2.抑肽酶對(duì)凝血酶致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用 24只SPF級(jí)雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(C組)、凝血酶100U/kg處理組(T組)、抑肽酶1×104KIU(激肽釋放酶抑制劑單位，Kallikreininhibitorunits)/kg預(yù)先給藥+凝血酶處理組(AT1組)

8、、抑肽酶4×104KIU/kg預(yù)先給藥+凝血酶處理組(AT2組)。動(dòng)物處死前15min(分鐘，minute)，經(jīng)尾靜脈注入1％FINa溶液(2ml/kg)。收集標(biāo)本檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞總數(shù)、肺濕/干比、肺微血管通透性；收集頸動(dòng)脈血分離血清以ELISA法測(cè)定檢查VEGF、TNF-α濃度；取右肺上葉組織切片，光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)的改變，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VEGF、TNF-α在組織中的表達(dá)。 結(jié)果

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.凝血酶誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型的建立 ①C0.5h組、T10.5h組、T112h組三組Fib比較，C0.5h組(3.05±0.28g/l)與T112h組(2.95±0.29g/l)相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，兩組均高于T10.5h組(0.673±0.44g/l)，差異非常顯著(P＜0.01)。②各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)比較無(wú)顯著差異。③與C組(W/D，5.10±0.11；FINa，1.31

10、±0.054ug/g；VEGF，10.03±1.75pg/ml；TNF-α，11.05±1.92pg/ml)比較，T1、T2組0.5h、12h點(diǎn)肺濕干比(T10.5h：6.04±0.10，12h：5.58±0.074；T20.5h：6.27±0.14，12h：5.68±0.086)、肺組織FINa(熒光素鈉，F(xiàn)luoresceinnatrium)析出量(T10.5h：2.03±0.057ug/g，12h：1.48±0.054ug/g；T

11、20.5h：2.55±0.127ug/g，12h：1.53±0.043ug/g)、血清VEGF(T10.5h：18.38±1.35pg/ml，12h：13.30±1.21pg/ml；T20.5h：24.69±2.78pg/ml，12h：14.06±1.16pg/ml)和TNF-α(T10.5h：21.82±2.10pg/ml，12h：15.00±1.68pg/ml；T20.5h：28.30±4.25pg/ml，12h：17.31±1.5

12、4pg/ml)表達(dá)均明顯增高，差異非常顯著(P＜0.01)，且T1與T2比較有差異，T2高于T1(P＜0.05)，其余各觀察點(diǎn)與對(duì)照比較則無(wú)顯著差異。④T1、T2組0.5h點(diǎn)肺組織VEGF和TNF-α表達(dá)陽(yáng)性最高，T1、T2組12h點(diǎn)次之，其余各點(diǎn)與對(duì)照組均呈弱陽(yáng)性表達(dá)。⑤C組及T1、T2組6h、12h各點(diǎn)的肺組織鏡下結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰、肺泡間隔無(wú)水腫、少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；T1、T2組0.5h、2h點(diǎn)的肺組織切片鏡下可見(jiàn)血管周?chē)[、肺泡

13、間隔水腫增寬、肺間隔中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但未見(jiàn)肺泡腔內(nèi)有炎細(xì)胞、紅細(xì)胞、滲出等病變。 2.抑肽酶對(duì)凝血酶致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用 ①各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)比較無(wú)顯著差異。②T組肺濕干比(6.04±0.10)、血清VEGF(18.38±1.35pg/ml)和TNF-α(21.82±2.10pg/ml)表達(dá)最高，與各組比較有顯著差異(P＜0.01)，其余各組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。③T組

14、肺組織FINa(2.03±0.057ug/g)析出量最高，與其余三組比較差異非常顯著(P＜0.01)，AT1組(1.43±0.057ug/g)比C組(1.31±0.054ug/g)、AT2組(1.34±0.057ug/g)略高(P＜0.05)，C組與AT2組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。④T組肺組織VEGF和TNF-α表達(dá)陽(yáng)性最高，其余各組均呈弱陽(yáng)性表達(dá)。⑤C組、AT1組及AT2組的肺組織鏡下結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰、肺泡間隔無(wú)水腫、少量

15、白細(xì)胞浸潤(rùn)；T組的肺組織切片鏡下可見(jiàn)血管周水腫、肺泡間隔水腫增寬、肺間隔中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但未見(jiàn)肺泡腔內(nèi)有炎細(xì)胞、紅細(xì)胞、滲出等病變。 結(jié)論 本研究據(jù)此得出以下結(jié)論： 1.注入大鼠體內(nèi)的外源性凝血酶能在一定時(shí)間內(nèi)維持生物活性，可以誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)有劑量依賴(lài)、隨時(shí)間衰減、以肺微血管通透性增高和白細(xì)胞聚集為特征的急性肺損傷。 2.本實(shí)驗(yàn)中凝血酶未能誘導(dǎo)BALF中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變。